福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度
一、原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

二、实验仪器
分光光度计,试管,移液管,容量瓶，分析天平，烧杯
三、实验试剂
1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液
甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中
乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml。

临用时按甲：乙=50：1混合使用。

2.Folin-酚试剂乙：将10g钨酸钠、2.5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏1小时，再加入硫酸锂15g，蒸馏水5ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。

冷却，稀释至100ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。

临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。

标准蛋白质溶液：称取1g牛（人）血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制
取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

各管加入1mlFo1in 酚试剂乙后，立即摇匀，放置15分钟后比色，在500nm 处记下各管光密度，以0号管为对照，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线
2.样品测定
准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。

室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in 酚试剂乙，立即摇匀，放置15分钟，在500nm 处测定光密度值。

五、实验结果
管号
试剂 1 2
样液（ml ） 1.0 1.0
Folin-酚试剂甲 5.0 5.0
（ml ）
标准曲线的绘制：
蛋白质浓度0.00 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 吸光度0.000 0.079 0.215 0.264 0.346 0.450 0.493
则根据y=5.5072x=0.325得x为0.05901，则样液的浓度为
0.5901mg/ml.
六、实验结果分析及思考
1、试说明Folin-酚法的优缺点
该方法较双缩脲法反应灵敏，与0.1mg/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。

2、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚B试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

Folin—酚试剂由A试剂和B试剂组成。

A试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。

蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸
钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。

B试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。

此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。

由此可见是它们的显色灵敏度不同造成的。

3、Folin 酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？
第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物(呈蓝色反应)，因此需要快速混匀, 继续实验。