福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度
一、目的
熟悉并掌握福林（Folin）—酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。

二、原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三、实验仪器
1.卵清蛋白片
2.7220分光光度计
3.试管
4.移液管
四、实验试剂
1. Folin-酚试剂A：碱性铜溶液
甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中
乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。

临用时按甲：乙=50：1混合使用。

2. Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。

冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。

临用时，用1mol/l 的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至
相当于1mol/L的酸。

3. 1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制
取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

0.1
0.2
0.3
0.4
0.45
0.5
牛血清蛋白液
OD500摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Folin-酚试剂B
摇匀，在室温下放置10分钟
0.5（样液）
4.0
0.5
4.0
0.4
4.0
0.3
4.0
0.2
4.0
0.1
4.0
0.05
4.0
4.0
(1mg/ml)ml
蒸馏水ml Folin-酚试剂A
样品
7
6
5
4
3
2
1
管号
2.样品测定
准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。

注：7200型分光光度计的操作程序
连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。

接通电源，使仪器预热20分钟。

用<MODE>键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。

用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。

将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。

一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。

将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0”
按MODE键选择A模式
将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。

当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。

六实验结果
根据线性关系，可求
Y=0.112*X---0.0547
X=(1.0897+0.0547)/0.112
=10.2178
故未知蛋白的浓度为1.02178 mg/ml
七实验分析
folin试剂中的磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）残基还原，发生显色反应：产生蓝色（钨兰+钼兰）。

蓝色的浓重度与蛋白质含量成正比。

所以如果酪氨酸含量高的话，测出的结果比实际值高一些
需要注意的是，用此方法测蛋白质时，还原反应发生在PH10的溶液中，而Folin试剂在碱性条件下不稳定，所以将Folin试剂加入碱性的铜和蛋白质溶液中必须立即混匀，此反应只在极短时间内有效进行。

试剂破坏后，还原性的生成物可再次反应，后者的变化于30min可达到最大值。

该方法较双缩脲法反应灵敏，与0.1mg/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。

可采用空白对照的方式消除误差。