兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
油乳剂检验
（1）粘度测定：流出法、Saybolt粘度计法。
吸管内口直径为1.2mm，室温下吸满lml乳剂，垂直放出0.4ml所 需时间作为粘度单位。
以 2-6 S为合格，不得多于10-15 S。 （2）乳剂稳定性测定： ① 加速老化法：疫苗于37℃贮存10-30d不破乳。
②抗原寻的（antigen targeting） 指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细
胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答 的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用 能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确 的免疫应答的目的。
A12(SO4)3· 18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O
（2）用明矾加碳酸钠合成法
2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑
（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成
A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl
用铝粉加烧碱合成法： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O A12(SO4)3· 18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O
分类 保 护 剂
复合物
糖类 盐类
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等
蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等
醇类
酸类 聚合物
山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等
柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
疫苗冻干保护剂组成
• 注意:佐剂和免疫增强剂的关系? • 有时佐剂也是免疫增强剂.
作用特点：
① 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生
特异性免疫应答。 ② 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足 够的免疫应答。
免疫佐剂作用机理
作用方式
① 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； ② 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； ③ 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释， 并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞， T细胞与B细胞）。
~2%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与
抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。
大量生产乳剂疫苗:
• 油相: 94％白油、6％司本-80、1%~2％硬脂酸铝，灭菌即可；
• 水相：抗原液加2％~4ห้องสมุดไป่ตู้吐温-80
• 乳化：将油相与水相按3：1~2：1比例配制，先缓速混合，再 通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。 或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2％吐温-80生理盐 水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。
乳剂配方与乳化方法
（1）剂在水中法：
将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生
成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该
法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。
（2）剂在油中法： 将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得 O/W ，如水相 直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该 法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5µ m左右，比较稳定。
取氢氧化铝干粉 50 ～ 55kg ， 加入6万毫升沸水中，搅拌均 匀;倒入硫酸100kg，爆沸至棕 褐色，经30～60min后，加温 水，边加边搅拌约至总量为 35 万毫升；用前加水稀释至 100万毫升，温度约为80℃， 盛装在一个缸内
两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸 内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH 6.9土0.1，继续熟化3min，稳定pH 6.9土0.1
保护剂（protector）的分类
分类： •（根据其作用机理） ——渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等 ——非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等 •（根据其分子量大小）
——高分子物质、低分子物质。
•（按其化学性质） ——复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
一些常用的冷冻干燥保护剂
免疫实验动物用的佐剂配制:
(1)弗氏佐剂：矿物油75%~85％，乳化剂15％~25%，混合后经 除菌过滤而成为 FIA ；如向其中加入 0.5mg／ m1 死结核杆菌即 为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合， 用力振摇即可成为均匀的乳剂。
(2) 白油佐剂：9份油和 1份司本-80混合后加 2％吐温-80和1％
佐剂的分类
1. 按佐剂物理性质 • • 颗粒型佐剂 非颗粒型佐剂
2. 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）
•
•
微生物及其组分
非微生物物质
3. 按佐剂在体内存留的时间 • • 贮存型佐剂（depot type adjuvant） 非贮存型（non-depot type adjuvant）
（一）颗粒性佐剂
静置沉淀，弃上清后加入约5倍量软 化水，搅拌洗涤、弃上清，如此3～ 5次，检查至硫酸盐合格为止。
另一缸盛80kg烧碱，加水至 100万毫升，加温至75℃
用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收 存于容器内，可约得600kg铝胶。
注意事项
① 氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。 ② 氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要 掌握好化合时的pH值。
3．SPGA保护剂
蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛血 清白蛋白10g、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。
免疫佐剂
一、佐剂概念与作用机理
1. 佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物 质称为佐剂。 佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同 时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗 原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质. 以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所改变，如 IL-2是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样, 具有免疫调 节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。
作用机理
① 抗原递呈（antigen presentation） ② 抗原寻的（antigen targeting）
③ 免疫调节（immune modulation）
①抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有
助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
冻干保护剂作用机制
① 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤； ② 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力； ③ 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。
二、影响保护剂效能的因素 1、保护剂种类: 根据微生物种类或者用途来添加不同种 类保护剂。 ２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。
1．盐类佐剂 氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。
2．油水乳剂佐剂
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗 氏不完全佐剂（ FIA）和矿物油白油佐剂。 3．免疫刺激复合物佐剂（ISCOM） 4．蜂胶佐剂（propolis）
5．脂质体佐剂（liposomes）。
6．其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（micro-encapsulation)、 硬脂酰酪氨酸佐剂和γ －菊粉等。