基金项目：深圳市科技计划项目（编号２０１１０３０３６）＊通讯作者文章编号：１００７－４２８７（２０１２）０５－０７９２－０３Ｔ２４膀胱癌细胞ＡＲＩＤ１Ａ基因的表达与细胞增殖活力相关性研究吴金斌１＊，漆正宇２，晏耀明１，翟庆娜１，余振东１（１．北京大学深圳医院检验科，２．北京大学深圳医院男性生殖与遗传重点实验室，广东深圳５１８０３６）摘要：目的 探讨ＡＴ丰富结合域１Ａ（ＡＲＩＤ１Ａ）基因的表达与膀胱癌细胞Ｔ２４增殖活力的关系，为进一步基因功能研究提供基础。
方法 利用梯度稀释法分离获得膀胱移行癌细胞系Ｔ２４的高增殖亚克隆细胞株，体外评价细胞株和亲代细胞系增殖活力差异，检测细胞周期调控基因ＣＣＮＤ１和膀胱癌肿瘤干细胞标志因子ＣＤ４４。
检测染色质重建复合物ＳＷＩ／ＳＮＦ亚基基因ＡＲＩＤ１Ａ在亚克隆和亲代细胞系的转录表达水平差异。
结果 分离得到６５个Ｔ２４的亚克隆细胞株，其中Ｔ２４－９亚克隆细胞株不同于亲代的梭形形态，呈细小的圆形形态，增殖能力明显强于亲代，ＣＣ－ＮＤ１、ＡＲＩＤ１Ａ和ＣＤ４４的ｍＲＮＡ表达量均有增加。
结论 Ｔ２４细胞系中的含有高增殖活力的干细胞细胞亚群，染色质重建复合物基因ＡＲＩＤ１Ａ转录活跃，可能增加ＡＲＩＤ１Ａ突变的风险。
关键词：膀胱移行细胞癌；Ｔ２４；ＡＲＩＤ１Ａ；增殖；亚克隆细胞株中图分类号：Ｒ７３７．１４文献标识码：ＡＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＲＩＤ１Ａｉｎ Ｔ２４－９ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ＷＵ Ｊｉｎ－ｂｉｎ１，ＱＩ Ｚｈｅｎｇ－ｙｕ２，ＹＡＮ Ｙａｏ－ｍｉｎｇ１，ｅｔ ａｌ．（１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ；２．Ｍａｌｅ ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０３６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＲＩＤ１Ａｇｅｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕ－ｍａｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ（ＴＣＣＢ）ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ２４．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｌｉｆ－ｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｉｒ ｐａｒｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ２４ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｂｃｌｏｎｅ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘ－ｐａｎｓｉｏｎ，ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ｂｉｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｒｏ－ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ，ｗｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＣＣＮＤ１，ＣＤ４４ａｎｄ ＡＲＩＤ１Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａ－ｔｉｖｅ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｔ ｔｅｓｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａ ｓｕｂｅｌｏｎｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ Ｔ２４－９ｆｒｏｍ Ｔ２４ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｓｕｂｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ－ｌｉｋｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌｅｒ ｔｈａｎ Ｔ２４ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｐｉｎｄｌｅ－ｓｈａｐｅｄｗｉｔｈ ｌｏｎｇ ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉｕｍ．Ｔｈｅ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ Ｔ２４－９ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｐａｒｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ２４．Ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔＴ２４－９ｇｒｅｗ ｆａｓｔｅｒ ｔｏ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ２４ｉｎ ７ｄａｙｓ．ＲＴ－ｑＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｓ ＣＣＮＤ１，ＣＤ４４ａｎｄ ＡＲＩＤ１Ａｉｎ Ｔ２４－９ｔｈａｎ Ｔ２４．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ２４Ｃｏｎｔａｉｎｓ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｕｂｕｎｉｔ ＡＲＩＤ１Ａｇｅｎｅ ｉｓｍｏｒｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＴＣＣＢ；Ｔ２４；ＡＲＩＤ１Ａ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｂｃｌｏｎｅ（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，２０１２，１６：０７９２） 膀胱癌是一类常见的泌尿系统恶性肿瘤，其中移行细胞癌占膀胱癌发病率的９０％以上［１］。
染色质重建复合物ＳＷＩ／ＳＮＦ亚基ＡＴ丰富结合域１Ａ基因（ＡＴ ｒｉｃｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎ １Ａ，ＡＲＩＤ１Ａ）是近两年来肿瘤研究关注的一个重要基因，膀胱移行细胞癌中ＡＲＩＤ１Ａ高比率突变［２］，但我们前期测序发现在膀胱癌细胞系Ｔ２４中ＡＲＩＤ１Ａ可以正常表达。
ＡＲＩＤ１Ａ作为一个染色质重建复合物亚基基因，跟细胞增殖密切相关［３］。
本研究通过有限稀释方法分离出膀胱移行细胞癌细胞系Ｔ２４的高增殖活力亚克隆细胞株，体外评价ＡＲＩＤ１Ａ表达与细胞增殖转移潜能关系，并为进一步研究ＡＲＩＤ１Ａ基因功能提供目的细胞。
１ 材料和方法１．１ 材料 基础培养基Ｈ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＵＳＡ），１０％胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ ＵＳＡ），左旋—２９７—Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｍａｙ，２０１２，Ｖｏｌ １６，Ｎｏ．５谷氨酰胺（Ｇｉｂｃｏ ＵＳＡ），青霉素和链霉素合剂（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ），胰酶（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ），Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ），ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６○Ｒ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕ－ｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ａ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ），Ｐｌａｔｉｎｕｍ○Ｒ ＳＹＢＲ○Ｒ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）。
１．２ 方法１．２．１ Ｔ２４细胞培养 Ｔ２４细胞系为本实验室保存，传代培养。
培养基包括９０％基础培养基Ｈ－ＤＭＥＭ，和１０％胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ），同时添加１ｍｍｏｌ／Ｌ左旋谷氨酰胺、１００Ｕ／ｍｌ青霉素和１００μｇ／ｍｌ链霉素合剂。
细胞消化采用０．２５％胰酶。
在培养基中添加１０％体积ＦＢＳ和８％ＤＭＳＯ配成冻存液，按常规流程液氮冻存细胞。
１．２．２ 高增殖亚克隆细胞株形成 将生长旺盛的Ｔ２４细胞从培养皿消化后，稀释到１×１０２个／ｍｌ，以１／２浓度梯度稀释接种到９６孔板中，５ｈ内在倒置显微镜下观察，标记单细胞孔，第１０天将从单细胞扩增形成的细胞亚克隆传至２４孔板，得到亚克隆细胞株。
亚克隆细胞株传代培养至第３代，均一化接种培养并每天计数显微镜视野细胞数，估测筛选高增殖细胞株。
１．２．３ 细胞增殖活力比较 采用ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６○Ｒ Ａ－Ｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ａ）试剂，ＭＴＳ法检测亚克隆细胞与Ｔ２４亲代细胞增殖活力，分别在１、３、５和７天选择时间点检测。
１．２．４ ＲＴ－ｑＰＣＲ检测 采用常规Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞ＲＮＡ。
逆转录反应采用Ｆｅｍｅｎｔａｓ Ｒｅ－ｖｅｒｓｅＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ，反应体系为２０μｌ。
采用Ｐｌａｔｉｎｕｍ○Ｒ ＳＹＢＲ○Ｒ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ ｋｉｔ对目的基因进行ｑＰＣＲ相对定量，比较细胞增殖相关基因ＣＣＮＤ１（ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）表达，并通过定量膀胱癌肿瘤干细胞标志基因ＣＤ４４来进一步验证细胞增殖特性。
定量ＡＲＩＤ１Ａ在不同增殖活力细胞中的表达。
目的基因及内参ＧＡＰ－ＤＨ跨外显子正反向引物序列（５′－３′）为：ＣＣＮＤ１（ｓｅｎｓｅ：ＦＧＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧ ＡＡＧ）；ＣＤ４４（ｓｅｎｓｅ：ＧＴＴＣ－ＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＡＡＴＴＡＣＴＣＴＧＣＴ－ＧＣＧ ＴＴＧ）；ＡＲＩＤ１Ａ（ｓｅｎｓｅ：ＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＴ－ＧＧＡＡＴＡ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＣＣＴＴＧＧＧＴＧ ＧＡＧＡＡＣＴＧＡ）；ＧＡＰＤＨ（ｓｅｎｓｅ：ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＣＡＴ ＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＣ）。
ＰＣＲ反应条件为９４℃２０ｓｅｃ，５５℃２０ｓｅｃ，７２℃２０ｓｅｃ，共３５个循环。
２ 结果２．１ 获得高增殖亚克隆细胞株Ｔ２４－９Ｔ２４分离得到６５株亚克隆细胞，其中Ｔ２４－９细胞株培养计数表现出较强的增殖活力。
２．２ Ｔ２４－９细胞形态学特征Ｔ２４－９体积较亲代Ｔ２４明显偏小，与Ｔ２４的纺锤形外形不同，Ｔ２４－９呈干细胞样的细小圆球形（图１）。
图１ Ｔ２４－９与Ｔ２４细胞形态学差异（ｂａｒ＝１００μｍ）２．３ 细胞增殖活力定量比较生长曲线显示，除传代第１天外，Ｔ２４－９在第３、５和７天较Ｔ２４具有更强的增殖活力（图２）。
图２ Ｔ２４－９和Ｔ２４生长曲线（ｎ＝４）２．４ 基因转录水平比较基因转录水平相对定量分析显示，增殖相关基因ＣＣＮＤ１在Ｔ２４－９中较Ｔ２４中显著高表达。
肿瘤干细胞标志物表达Ｔ２４－９高于亲代Ｔ２４，但差异并不显著。