胡萝卜素提取的设计方案一，实验目的1、学习柱色谱法、薄层色谱法的原理及其方法。

2、掌握从胡萝卜中分离提纯胡萝卜素的原理和方法。

3、学会用色谱法从胡萝卜中提取胡萝卜素并鉴定之。

4、初步了解胡萝卜素的来源以及生产方法。

二，实验原理：β－胡萝卜素可通过化学合成，植物提取和微生物发酵3种方法生产，根据生产方式不同分为化学合成β－胡萝卜素和天然β－胡萝卜素两大类。

本实验是从胡萝卜中提取天然β－胡萝卜素。

而提取的方法可选择色谱法。

因为色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。

具有极其广泛的用途。

色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分开。

流动的混合物溶液称为流动相，固定的物质称为固定相（可以是固体或液体）。

根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等；根据操作条件的不同，又可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。

1、柱色谱法柱色谱（柱上层析）常用的有吸附柱色谱和分配柱色谱两类。

前者常用氧化铝、硅胶作固定相。

在分配柱色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。

吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。

当待分离混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。

当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或者将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

对于柱上不显色的化合物分离时，可用紫外光照射后所呈现的荧光来检查，或在用溶剂洗脱是分别收集洗脱液，逐个加以鉴定。

2、薄层色谱法薄层色谱法（ThinLayerChomatography，缩写TLC）是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。

它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。

薄层色谱是在载玻片上才、均匀铺上一薄层吸附剂，制成薄板，用毛细管将样品点在起点处，把此薄层板置于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm，待展开剂前沿利顶端约1cm附近时取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色，测定斑点位置，计算比移值（Rf）。

由于层析是在薄层上进行的，故称为薄层层析。

薄层色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。

一般能用硅胶或活性氧化铝薄层色谱分开的物质，也能用硅胶或氧化铝柱色谱分开，凡能用硅藻土和纤维素作支持剂的分配柱色谱能分开的物质；也可分别用硅藻土和纤维素薄层色谱展开，因此，薄层色谱常用作柱色谱的先导。

同时也可以用吸收剂非极性大孔吸附树脂，具本实验的类胡萝卜素具有末端带环的长链结构，故平均孔径为290～300A的X-5大孔吸附树脂更利于他们的吸附和吸附过程中的传质。

3、胡萝卜素的分离β-胡萝卜素分子中的碳骨架是由8个异戊二烯单位连接而成的，是四萜类化合物。

它的分子中有一个较长的π-π共轭体系，能吸收不同波长的可见光，因而，呈现一定的颜色，β-胡萝卜素是黄色物质，所以，又叫做多烯色素。

β-胡萝卜素的结构式如下：胡萝卜素是最早发现的一个多烯色素。

后来，又发现了许多在结构上与胡萝卜素类似的色素，于是就把这类物质叫做胡萝卜色素类化合物，或者叫做类胡萝卜素。

这类化合物大都难溶于水，易溶于弱极性或非极性的有机溶剂，因此又把这类物质叫做脂溶性色素。

胡萝卜素是一种天然的食物色素，主要存在于深色蔬菜，绿色、红色、深绿色的蔬菜中和黄色的，橘色的水果(如胡萝卜、菠菜、生菜、马铃薯、番薯、西兰花、哈蜜瓜和冬瓜)等有色植物中。

胡萝卜素与维生素A结构相近，活性较高的有α、β、γ胡萝卜素，其中β胡萝卜素活性最高。

胡萝卜素是一种脂溶性色素，脂肪有助于它被人体的吸收。

β胡萝卜素的主要作用是：1．它是高效的维生素a源，在体内，根据体内维生素A量的多少，β胡萝卜素可自动分解而补充维生素A的不足。

而且，胡萝卜素食一种十分安全的维生素A原，可较多地贮存在肝脏内，根据人体内维生素A的水平，胡萝卜素可自动逐步转化为维生素A，不会由于维生素A过量而中毒。

2．对体内氧自由基的清除作用。

氧自由基是引起肿瘤、衰老、心血管疾病的主要原因之一。

天然β－胡萝卜素的独特结构使它充当了体内氧自由基的“清道夫”，从而起到防癌、抗衰老的重要作用。

3．免疫保护作用,天然β－胡萝卜素可提高体内各种免疫淋巴细胞的数量和增殖反应能力，增强自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤作用和中性细胞的吞噬作用，从而巩固了人体的防御体系，起到祛病防身的作用。

β－胡萝卜素用途十分广泛,在医药方面具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老提高免疫力等作用; 在食品和饮料添加剂方面更是一种非常重要的天然色素, 是世界公认的优秀有营养的添加剂; 在化妆品领域, 其优良的着色性能使口红、胭脂色泽自然丰满, 又能起到营养和保护皮肤作用; 在饲料中添加可使畜禽强壮, 排卵和受孕能力加强。

β-胡萝卜素的分子式均为C40 H56 ，分子量为536.85，熔点184℃，深红紫至暗红色有光泽的斜6面体或板状微结晶的晶体或晶性粉末。

β-胡萝卜素具有两边反向对称的化学结构，分子结构中包含两个β-紫罗酮环和四个异戊二烯。

本实验的β-胡萝卜素是全反式-β-胡萝卜素。

β-胡萝卜素是不饱和碳氢化合物，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、正已烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂。

根据上面的性质，β－胡萝卜素常用的提取方法有：有机溶剂提取液法，酶反应法，微波辅助提取法，超声波辅助提取法，超临界流体萃取法等。

本实验采用有机溶剂提取法，故可利用石油醚、丙酮、无水甲醇、乙酸乙酯和无水乙醇等弱极性溶剂作为提取剂将它们从植物材料中浸提出来。

然后，根据它们对吸附剂吸附能力的差异，用柱色谱进行分离，用薄层色谱检测分离效果。

本实验采用的是以丙酮有机溶剂萃取类胡萝卜素，以石油醚为洗脱剂，柱内填充为硅胶进行柱色谱分离，然后在以（1：9）丙酮一石油醚溶液为展开剂进行薄层色谱检测分离效果。

三、仪器和试剂仪器三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸馏瓶（50ml）、普通蒸馏装置（或减压蒸馏装置）、漏斗、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、层析缸。

试剂胡萝卜、丙酮、石油醚（bp30~60℃）、硅胶（层析用，200~300目）、无水硫酸钠、石油醚（bp60~90℃）、丙酮：石油醚（1：9）（V/V）。

四、实验装置图五、实验步骤1、含胡萝卜素石油醚溶液的制备将新鲜胡萝卜洗净、擦干,切去尾部，切碎。

称取碎鲜胡萝卜10g于小研钵中,研碎。

碎胡萝卜移至50mL三角烧瓶中，每次用丙酮10mL萃取2次，再用石油醚（bp30~60℃）萃取固体两次，每次10mL。

把石油醚溶液加到丙酮液中。

在分液漏斗中将混合液与50mL 饱和氯化钠溶液振荡，分去下层，用蒸馏水洗涤上层液两次，每次50mL，分去水，用无水硫酸钠干燥石油醚液（约1h）,把混合液倒入50mL圆底烧瓶中，热水浴加热蒸馏，除去溶剂，得固体。

在制得的固体物加入3mL石油醚（bp60~90℃）拌硅胶1g，在通风橱内抽干，得黄色硅胶颗粒，待上柱。

2、装柱和分离(装置如图1)取20cm*1cm色谱柱一根，垂直装置，以50ml三角烧瓶作洗脱液的接受器。

用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部，轻轻塞紧，再在脱脂绵上盖一层厚0.5cm的海石砂（或用一张比柱内径略小的滤纸代替），关闭活塞，向柱内倒入石油醚（bp60－90℃）至约为柱高的3／4处，打开活塞，控制流出速度为1滴/s。

通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入层析硅胶。

用洗耳球轻轻敲打柱身，使填装紧密。

当装填到3/4时，再在上面加一层0.5cm厚的海石砂，操作时一直保持上述流速，注意不能使液面低于砂子的上层。

当液面流至离海石砂面1cm时，立即从玻璃漏斗加入已制备好的含胡萝卜素的黄色硅胶，随后用0.5ml石油醚洗下管壁的硅胶，如此连续2—3次，直至洗净为止，然后在色谱柱上装上滴液漏斗，用石油醚（bp60－90℃）作洗脱剂进行洗脱，洗1滴/s 。

当有一黄色的谱带分出，待黄色组分绝大部分洗出时，把洗脱剂换成1：9丙酮一石油醚（bp60－90℃）混液作洗脱剂进行洗脱，控制流出速度如前（这混液洗脱剂有助于混合物中极性较大的组分移动），又可分出两个黄色组分。

在45—90min内，柱中物料将全部洗脱出来。

观察这些物料通过柱子的移动情况。

在三角烧瓶中收集3份洗出液。

用纸色谱、薄层色谱对各段洗出液进行色谱分析。

3. 薄层色谱法样品：柱色谱法中洗脱出的份样品液展开剂：1：9丙酮一石油醚溶液薄层板的制备：取3片载波体，洗净，晾干。

在50ml烧杯中放置3g硅胶G，逐渐加入0.5%cmC水溶液8ml，调成均匀的糊状，将此糊状物倾于上述洁净的载玻片圣桑，用手将带浆的载玻片在水平的桌面上做上下轻微的颤动，并不时转动方向，制成厚薄均匀，表面光洁的平整的薄层板，然后放在水平桌面上，在室温放置晾干后放入烘箱中，缓慢升温至110℃，恒温0.5h，取出，稍冷后置干燥器中备用。

点样：取出上述制好的薄层板，分别在距一端点1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。

用毛细管吸取少量样品液，在一块板的起点线上点第一个色带的样品液，根据柱色谱分离的色带，依次点样，如果样点颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点挥干后进行。

样点直径不超过2mm。

展开：待样点干燥后，小心地放入已加入展开剂的250ml广口瓶中进行展开。

在瓶的内壁贴一张高5cm，环绕周长4/5的滤纸，下面浸入展开剂中，以使容器内被展开剂蒸气饱和。

点样一端浸入展开剂0.5cm（样点不浸泡在展开剂中）。

盖好瓶塞，观察展开剂前沿上升离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后，量出展开剂和样点移动的距离，计算Rf值。

六、注意事项1、本实验采取的工艺不同于其他工艺，体现在原料粉碎时加入了稳定剂（5ml氨水和35ml 乙醇）来防止β－胡萝卜素被氧化，由此可提高提取率。

2、色谱柱填装紧密与否，对分离效果很有影响。

若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层或暗沟）时，会影响渗滤速度和显色的均匀。

但如果填装时过分敲击，又会因太紧密而流速太慢。

3、加入砂子的目的是。

在加料是不致把吸附剂冲起，影响分离效果。

4、为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶液或溶液中是必要的。

否则当柱中溶液流干是。

柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。

5、若不用滴液漏斗，也可用每次倒入10ml洗脱剂的方法进行洗脱。

6、载玻片上涂层要均匀，既不应有纹路、带团粒，也不应有能看到玻璃的薄涂料点。