3、果胶酶的酶活测定方法
粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。
还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。
附加条件：诱导物、表面活性剂等
5、酶催化反应的进行受多种因素的影响
底物浓度酶浓度温度pH激活剂抑制剂
三、实验材料
（一）试剂
1、酶活测定用试剂和DNS
2、新鲜果汁
（二）仪器
烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；
天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。
2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基
菌种斜面培养基（查氏培养基）
NaNO30.2%K2HPO4 0.1%
KCl 0.05%MgSO4 0.05%
FeSO4 0.001%蔗糖3%
琼脂2.5%自然pH
种子培养基
麸皮3.0%，橘子粉2.0%，硫酸铵0.5%,
葡萄糖1%，KH2PO4 0.1% pH4.5
固体发酵培养基：5瓶/组
是
小组成员
高胜全李朝和刘云谣罗光洪张志豪
一、实验目的：
1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；
2、了解酶学性质的研究.
二、实验原理：
1、理论依据
（1）、果胶酶概况
（2）、果胶酶的酶活测定方法
（3）、微生物发酵生产特定产物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约
（4）、酶催化反应的进行受多种因素的影响
液体培养：将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内，30℃，200rpm，培养约40h，备用。
2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响(第一组）
选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。
在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约5%，即1.5ml）相同培养条件下（30℃，60h）发酵，测定酶活。
麸皮10g，橘子粉2.5g，(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料计）
葡萄糖0.125g（1%干料计），水15ml
要求：
按组统一配制后分装三角瓶
先将(NH4)SO4、葡萄糖用水溶解，再加其它。
四、实验方法、步骤及注意事项：
（1）固体发酵果胶酶
1、菌种准备
菌种活化：试管保存菌种→斜面活化→30℃培养约60h
4、培养基含水量对产酶的影响(第三组）
在发酵培养基中加入蒸馏水，使培养基中的含水量分别约为50%、55%、60%、65%和70%；保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5%，即1.5ml）相同培养条件下（30℃，48~60h）发酵，测定酶活。
5、接种量对产酶的影响(第三组）
分别以4%、5%、6%、7%和8%的接种量接种果胶酶产生菌于发酵培养基中，在相同的培养条件下（30℃，48~60h）发酵，测定酶活。
2、果胶酶概况
果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。
果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。
产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和Βιβλιοθήκη 菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。
果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
制备酶液：称取0.1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释100倍），纱布（4层）过滤去除杂质；
如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。
（2）果胶酶酶活测定方法
OD =（A+B）/ 2
（三）培养基
1、菌种筛选使用
2、黑曲霉Asp-2固体发酵用
1、菌种筛选使用培养基
⑴基本培养基:
果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，琼脂2.0%。
⑵分离培养基
果胶0.5%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂2.0%，pH4.5
（3）发酵培养基
果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。
发酵工程学实验
组号：7-8节第七小组学号：124120434
学院：生命科学学院专业、班级：12生物技术
实验课程名称＿发酵工程实验
指导教师及职称唐湘华
开课学期2014至2015学年下学期
云南师范大学教务处编印
实验名称：（一）特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究
实验时间
第十三周
实验室
睿智3-121
小组合组
保持培养基成分和接种量（5%，即1.5ml）不变，分别
在室温、30、37和45℃的温度条件下发酵48－60h，
测定酶活。
先把培养箱调到相应的温度！
8、果胶酶酶活的测定
（1）待测酶液的制备
烘干：把发酵产物倒于平皿中，45℃烘干过夜；
制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；
注意：由于接种的是液体菌种，所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。
6、发酵时间对产酶的影响（第四组）
在相同的培养基、相同的接种量（5%，即1.5ml）和相同培养条件下（30℃）分别发酵36、48、60、72和84h，测定酶活。
注意：精确计算时间，准时取出发酵产物。
7、发酵温度对产酶的影响（第五组）
DNS法：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
4、微生物发酵生产产品受以下条件制约：
培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子
培养条件：温度、pH、溶解氧等
3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响(第二组)
选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%、3.%的选择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%，即1.5ml），相同培养条件下，30℃，发酵60h，测定酶活。