一、实验目的：1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。

称量技术：1、了解电子天平的用途2、了解电子天平的工作原理3、掌握电子天平的使用方法4、掌握电子天平使用前后的注意事项离心技术：1、了解离心机的基本原理和用途2、了解离心机的类型和用途3、了解离心机的型号和控制版面4、掌握离心机的使用方法5、掌握离心机使用的注意事项层析技术：1、了解层析技术的基本原理2、了解层析技术的分类情况3、了解各种层析技术的原理4、掌握凝胶层析技术光谱分析技术：1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理2、了解仪器结构和分类3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项电泳技术：1、了解电泳的基本原理2、了解电泳的类型3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理4、掌握垂直板电泳的操作技术5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术6、了解转移电泳的基本原理和操作方法7、了解双向电泳的基本原理和操作方法二、实验原理：1、蔗糖酶的提取：①酵母菌的基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。

长5-30μm，宽1-5μm。

②生物材料破碎方法：（1）机械（匀浆）法①研钵②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。

③高速组织捣碎机（0.5-1L）将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

④高压匀质机（XL）高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。

优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。

一次破碎效率可达90%以上（2）超声波处理法用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。

（3）反复冻融法将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！（4）化学处理法有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。

（5）溶胞作用(酶溶解法)用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。

常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。

（6）自溶法将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。

2、蔗糖酶的纯化：①酶与蛋白质纯化过程的独有特点：（1）特定的一种酶在细胞内的含量很少……纯化困难（2）可以通过测定活力的办法加以跟踪……寻找关键②酶的纯化方法：1.酶的蛋白属性；两性电离：蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

等电点(isoelectric point, pI)：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。

大分子(胶体)：分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。

稳定的因素：颗粒表面电荷水化膜2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀（1）改变离子强度；盐析硫酸铵分级沉淀（反抽提法）反抽提法（Back Extraction）例：E.coli RNA聚合酶42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀通常方法：先33%-------再50%反抽提法：再42%将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。

蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性。

（2）改变pH或温度；改酶变在介未电纯常化数之；前PI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。

Cu,Zn-SOD的纯化可在70 oC，10 min。

（3）改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。

亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。

亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。

有机溶剂分级沉淀操作条件的控制：溶剂选择：常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。

沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。

温度：使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。

样品浓度的控制：一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2% 为好。

3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析（1）离心分离；最为常用分布在细胞器匀浆后离心（2）透析、超滤；利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的扩散运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法.用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。

用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。

（3）凝胶层析；凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。

利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析凝胶层析常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。

凝胶层析的基本原理：凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。

在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。

凝胶层析的应用范围：凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。

分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。

利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。

凝胶层析的特点：凝胶层析操作简便，所需设备简单；分离效果较好，重复性高。

最突出的是样品回收率高，接近100％；分离条件缓和。

凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响；应用广泛。

适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。

分离的分子量范围很宽，如Sephadex G类为102～105D；Sepharose类为105～108D。

4.根据酶分子电荷性质的分离方法；离子交换层析离子交换层析基本原理：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。

离子交换分离的基本步骤---平衡-上样-吸附-洗脱-再生如何选择离子交换介质：对pI=5的某酸性蛋白质，当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂离子交换纤维素：树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类；特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高；离子交换纤维素的预处理：适量水浸泡，漂洗，使之充分溶涨；数十倍的0.5mol/L氢氧化钠液反复浸泡0.5～1h，每次换液皆须用水洗至近中性；按交换的需要用平衡离子处理；最后以交换用缓冲液平衡备用。

5.根据酶分子专一性结合的方法;（1）亲和层析技术；Bioaffinity 生物亲和作用a. 寻找可与蛋白专一性结合的配基（L）；b. 将配基（L）通过共价键偶联到载体，并使L与P亲和力不变；c. L与P吸附并与杂质分离，将杂质洗出；d. 洗脱目标物，实现纯化。

（2）亲和超滤；亲和——高度专一性超滤——高处理能力（3）金属亲和层析利用金属离子的配合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。

蛋白表面暴露的供电子氨基酸残基咪唑基、巯基、吲哚基。

Cu 和Zn 可以很好的与咪唑基和巯基结合。

优点：①蛋白质吸附容量大；②价格便宜投资低；③具有普遍适用性；（4）拟生物亲和层析利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白的亲和层析，尤以氨基酸（包括多肽）亲和层析为代表。

3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定：①酶活力(enzyme activity)酶催化某一反应的能力——VV——单位时间内单位体积中底物(substrate) 的减少量或产物(product) 的增加量。

②条件：1、催化反应总的反应式；2、酶是否需要某种辅助因子(cofactors)；3、酶最适时的pH和温度。

哺乳动物的酶，最适温度通常在25 —37℃。

1、测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度(initial velocity or initial speed)(如每分钟底物转换的μmol)（2）酶速度(velocity)：酶催化反应的速率，酶速度通常记录为时间为0 时的值(符号V0 :μmol／min)，以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于V0。

（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。

（4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。

[S]的选择原则：线性范围越宽越好，但不宜太大2、酶活力和比活力表示方式酶活力单位：国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量。

催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。

1 IU= 16.67×10-9 kat酶的比活力(specific activity，也称比活性）比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。

比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每g或每ml 酶含多少个活力单位来表示活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数(U/mg蛋白)。