在旱地土壤中产甲烷古菌活性对养牛业的影响维维安radl1,5，安德烈亚斯gattinger1,5，艾莉卡时ˇ一´可娃´2,3，安娜NEˇmcova´2,3，Jiri Cˇuhel2,3，米洛斯拉夫的ˇimek2,3，让查尔斯munch1,4，迈克尔schloter4和Dana elhottova´21土壤生态学，慕尼黑工业大学，上施莱斯海姆，慕尼黑，德国；2生物中心，土壤生物学研究所，Cˇ艾斯克´不得ˇjovice，捷克共和国；3生物科学，南波西米亚州大学，Cˇ艾斯克´不得ˇjovice，捷克共和国；4gsf国家研究中心环境与健康，土壤生态，Neuherberg学院，德国。

在本研究中，我们测试的假设是动物的行走与作为越冬牧场土壤中的甲烷有机物有关。

因此，捷克共和国指出，在波西米亚南部的一个农场中，甲烷排放量和产甲烷菌种群对牛有不同程度的影响。

在春天，甲烷排放与动物影响的梯度相一致。

分析应用磷脂，该古细菌量最高的影响，发现部分（SI）对其有影响，其次是温和的影响（MI）没有影响。

对于产甲烷菌的实时显示甲基辅酶M还原酶（MCRA）基因的定量PCR分析观察到了相同的趋势。

检测单不饱和脂肪酸异戊烯基侧链的碳氢化合物（i20:1）表示的乙酸分解的存在影响牛产甲烷菌。

这个结果是由mcrA基因序列分析证实得到的，这表明，所分析的克隆的33%属于甲烷。

克隆序列的大部分（41%）与未培养瘤胃有关。

由此可得到的假设是，相当大的一部分来自放牧本身产生甲烷的区域。

相比于春天采样，在秋天，古细菌的生物量和mcrA数显著减少主要用于截面MI基因观察。

可以得出结论，5个月后没有牛的影响，严重影响了部分保持其产甲烷的潜力，而在温和的冲击后甲烷生产潜力。

期刊名称（2007）1，443，452–；DOI: 10.1038/ismej.2007.60；网上公布19七月2007学科类别：微生物生态学和自然栖息地的功能多样性关键词：多样性；甲烷排放；甲基辅酶M还原酶引言农业对于在土壤和植物生物量的二氧化碳（OCA，2006）气体减排和系统隔离提供了巨大的潜力。

在这方面，山地草原在低投入农业系统中被认为是作为温室气体甲烷（CH4）（胡¨tsch等人。

，1994）和只有微弱的来源的氧化亚氮（N2O）（莫西尔等人。

，1991）。

然而，当草原用作牧场放牧时这些减排潜力可以改变。

例如，克莱顿等人（1994）发现，一个放牧的牧场的N2O排放量比不放牧的草地高三倍，并且推测踩踏和排泄的相互作用会刺激这个过程。

动物踩踏时通过土壤压实造成土壤通气减少，从而增强的反硝化率（menneer等人，2005）。

此外，踩踏可以使丰富的有机碳物质从粪便进入土壤，刺激微生物代谢，从而增加在较低的土壤深度氧的需求（Sˇimek 等人，2006）。

厌氧环境和可用的有机碳可能有利于甲烷碳。

事实上，一些研究表明，在施用有机肥后，甲烷排放量的时间会增加。

虽然在畜牧业中甲烷通量变化对土壤强度有影响，在这样的环境中的古菌群落中，甲烷的结构和功能的数据可能会丢失。

因此，这一客观研究的目的是确定畜牧业中对甲烷排放量对土壤的丰富性和多样性在产甲烷社区室外越冬的影响。

特别是，对以下假设进行了测试：（1）牛越冬放牧导致土壤功能的变化，可导致甲烷的排放而不是甲烷的下沉，（2）排放量与动物的影响有关及（3）牛的粪便作为瘤胃产甲烷菌接种和刺激土传病原菌的生长和活动。

对于产甲烷古菌生物量的特征，我们使用了磷脂（PLEL）方法（gattinger等人，2002，2003年）。

该方法的分类分辨率相对较低，但其坚固性对不同土壤基质不一样，这已被证明（白等人，2000；瓦辛格尔。

等人，2000；瓦格纳等人，2005）。

此外，实时定量PCR和克隆库的分析甲基辅酶M还原酶（MCRA）基因，这对甲基辅酶M还原酶的A亚基编码，进行了更详细的调查研究对于产甲烷的结构。

这种酶催化还原甲基辅酶M导致释放甲烷（埃等人，1988）。

mcrA 基因的存在限制产甲烷古菌（thauer，1998）；因此，它的数量作为一个土壤中的产甲烷生物量估算。

在本研究中，我们表明，在越冬时使用的急剧变化的草原土壤的性质，这反过来又影响土壤产甲烷菌的数量和活性。

材料和方法试验场在南波西米亚捷克共和国（纬度481520 N，东经141130 E）对位于博罗瓦农场附近过冬的牛进行了调查。

约4公顷的面积已被约90头母牛从1995年（详情见ˇimek等人，2006）用于越冬（十月/十一月至四月/五月）。

土壤是沙质壤土，分类为雏形土，含有60–80%砂，14–32%淤泥和6–14%粘土（根据美国农业部的分类系统）。

植被是一种多年生的混合物草，三叶草和其他双子叶植物。

长期平均年降水量是650mm和年平均气温71C（从位于气象站7公里实验农场测得的数据）。

在冬季结束的时候（4月至5月），有一个由于对畜牧业的可见梯度的影响。

对越冬场所的影响程度与整个牧场不相同。

我们研究了这种梯度的三个部分：最受影响的地区位于牲口棚的附近（有1/4严重影响），影响较小的区域是梯度的中间部分（有1/4温和的影响）和不受影响的地区在越冬区的相对侧（部分1/4没有影响）。

在春天，研究区域的特点如下：硅完全被植被破坏，通过粪便破坏了土壤结构和饱和度；温和的影响是通过部分植被破坏和保留了土壤表面的粪便；影响小的是通过覆草和保留了不可见的粪便。

甲烷通量的测量和土壤取样该实验进行了两次，在春季（2005年5月11日），从动物从越冬区域移在秋季（2005年10月18日），从它们回来之前。

在每个区域的不同部分随机选择了一些区域进行了气体流量测量和土壤取样独立的区域可以重复在这项研究中。

甲烷通量决定在中间部分使用（断面积0.076m2，体积15dm3）。

在测量之前立刻推进到土壤3厘米处。

每个区域有一个橡胶隔膜立即插入之后进行安装。

顶部的气体样品在60分钟后被收集在室内。

初步调查显示，气体浓度在封闭区域是线性增加的。

在每个部分采集九种气体样品，存储在预先抽真空的3.5ml的小玻璃瓶中，立即送到实验室进行分析。

使用惠普5890系列II气相色谱仪（休利特帕卡德，帕洛阿尔托，CA，USA）装备用2M Porapak N列在7501c，和火焰电离检测器进行甲烷数量的测定。

仪器的校准用CH4的标准混合物，对于甲烷气体从玻璃瓶转移时的损失其结果正确的。

与气体采样相比较，真实的土壤样品是从四个区域获得的（0–20厘米深），通过采集七个附属样品，从直径为3厘米的土壤区域随机采取。

土壤立即通过5毫米的网格进行均匀化筛分。

对样品进行核酸和磷脂的分析并立即分别存储在 801c和41。

由于在分析的这些区域观测到很不均匀，因此重复测量了大多数气体。

土壤分析在1051度进行干燥，土壤的PH值使用在1:2.5（w/w）土壤/水悬浮液中的玻璃电极测量。

土壤中的无机氮（NH4þ，NO3）通过从1M氯化钾提取使用的土壤（新鲜现场潮湿的40克溶液比：200毫升（ZBı´RAL等人，1997）测量。

总有机碳测定采用重铬酸湿式氧化法（杰克逊，1958），采用凯氏定氮法测定总氮含量（ZBı´RAL，1995）。

总生物量和古细菌的测定采用PLFA法和PLEL法从新鲜土样中提取的脂类相当于10克干重（干重），根据布莱–代尔方法描述（zelles和白，1993）。

由此产生的脂质材料分离成中性脂质，糖脂和在二氧化硅的磷脂键合（spe-si；Bond Elute，分析化学国际，美国）分别通过洗脱氯仿和丙酮甲醇。

磷脂的等分试样分数相当于2.5克干重为磷脂脂肪酸（PLFA）分析。

在温和的碱性水解后，oravecz等人进行了详细描述（2004年），所得到的脂肪酸甲酯利用自动识别系统在毛细管气相色谱分离（Agilent 6850，氢火焰离子化检测器，tsba50，MIDI公司，纽瓦克，德，美国）。

另一部分的磷脂馏分相当于7.5克土壤干重采用PIEL法分析根据gattinger 等人的分析（2003年）。

在乙醚核心脂质形成后，醚连接类异戊二烯释放后裂解醚键与HI和还原脱卤在冰醋酸锌。

由此产生的类异戊二烯烃溶解在100毫升标准溶液内（十九烷甲基酯）进行气相色谱-质谱联用在操作条件进行了光谱分析（gattinger等人，2003）。

PLFA / PLEL个别化合物数据（用1 nmol克土壤干重表示）被添加到获得的总磷脂浓度链，土壤中微生物总量（zelles，1999）。

PLFA/PLEL化合物总浓度磷脂链的百分比表示，给出了一定微生物组的相对丰度估计（zelles，1999）。

以下简称为不同PLEL派生的类异戊二烯烃：i20:0表明饱和和单不饱和i20:120个碳原子的类异戊二烯链i40:0；表示一个类异戊二烯链的40个碳原子。

从土壤中提取DNA从500mg土壤中提取DNA被格利菲斯等人描述（2000年）。

提取物的数量和质量采用分光光度法测定（纳米微滴，peqlab，埃朗根，德国）。

实时定量PCR的mcrA基因实时定量PCR（qPCR）在ABI PRISM 7700序列检测系统进行（珀金埃尔默，福斯特市，CA，USA）。

反应混合物含有5毫升的qPCR ROX 和Go Green （qbiogene，伊尔基希，法国），1.5毫克牛血清蛋白（西格马-奥德里奇，德国），每种物质5mol（卢顿等人，2002），5%二甲基亚砜（西格马-奥德里奇，斯德海姆，德国），0.5毫升的DNA模板和水的最终体积25毫升。

由初始951度变性15 min和941度变性1min4放大到在721度和521度各 1分钟。

标准曲线是通过使用10倍的稀释部分稀释马氏甲烷八叠球菌mcrA基因序列建立的。

计算出的PCR扩增效率使用的数据来自标准曲线和下面的公式：[10( 1/slope)] 1。

DNA的提取物质影响废弃物质，对每个样品进行稀释。

每个样品进行四个独立的测定。

通过放大熔融的PCR产物的质量曲线和确认用1.5%溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。

mcrA基因的克隆和测序从第四提取物中提取五十微克的复制为模板对于mcrA基因的扩增。

对以上所描述的反应进行了混合和放大，除了聚合酶以外（Taq聚合酶，Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国）。

纯化的PCR产品从四个重复汇集和克隆TA克隆试剂盒（Invitrogen公司），按照制造商的说明。

反应中PCR产物中Ca 50纳克，缓冲液1毫升，2.5毫升的无菌蒸馏水，2毫升矢量（PCR 2.1）和T4连接酶1毫升。

白色的殖民地，包括插入，接种50 MLML 1卡那霉素Luria–金氏培养基，一夜之间长大和用于质粒分离（Qiagen质粒抽提试剂盒，QIAGEN，希尔登，德国）。