培养基的湿热灭菌原理
由于培养基灭菌大多数用湿热灭菌，在这里我主要介绍湿热灭菌。

衡量热灭菌的指标很多，最常用的是“热死时间”，即在限定的温度下杀死原有微生物中一定比例所需的持续时间。

影响热灭菌的温度和时间的因素很多，包括：微生物种类、性质、浓度和培养基的性质、浓度等。

（一）热灭菌的原理
1、微生物的热阻
在这里先讲几个概念：
①致死温度：杀死微生物的极限温度。

②致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。

③微生物的热阻：表示微生物对热的抵抗能力，即指微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。

其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。

④相对热阻：某一微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。

例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；病毒/大肠杆菌=1—5/1等。

2、对数残存定律
微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。

因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：
-dN/dt = k * N
式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。

该方程称为对数残存定律，表示微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。

3、理论灭菌时间的计算
将上式积分，转换得：
t=1/k×lnN
0/N
t
=2.303/K×lgN
/N
t
式中：N
—开始灭菌（t=0）时原有活菌数； Nt----经时间t后残存活菌数。

k：意义同上；t ：表示理论灭菌时间
k=（2.303/t）logN
t /N
；比死亡速率常数K，K值大，表明微生物容易死亡。

理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：
（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大，K值也越小。

可以取耐热性芽孢杆菌的K进行计算。

(2)在计算过程中，N
0，N
t
如何取值？
N
为灭菌开始时培养基中活微生物数，可以参考一般培养基中的活微生物数为（1-2）×107个/ml； Nt 通常取 0.001个，既灭菌失败的概率为千分之一。

（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，实际的设计和操作计算时间可作适当比例的延长或缩短。

在实际生产中，通常采用经验数值：间歇灭菌，121℃，20—30分钟；连续灭菌，137℃，15—30s，在维持罐中保温8—20分钟。

4、灭菌温度的选择
在培养基灭菌过程中，除了杂菌死亡，还伴随着培养基成分的破坏。

因此必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降低至最低的工艺条件。

许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：
式中—表示营养成分破环的速率，
C：表示营养成分的浓度
K'：为反应速度常数，1/s，应速度常数K'与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：
K'= A'exp- △E'/RT (1)
式中—— K'：反应速度常数，1/S
A：反应的活化能（J/mol）
R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k
T：反应的绝对温度，k
同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出：
K = A×exp[-E/RT] (2)
（1）、（2）式可以改写成下列形式：
lg(k,2/k,1) = E,/R×(1/T1 – T2 ) (3)
lg(k2/k1) = E/R×(1/T1 – T2 ) (4)
（3）（4）的意义是指：反应的温度从T1 升高到 T2 ，其反应的速度常数分别从k,1 增加到 k,2；k1 增加到 k2；
培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：
lg(k2/k1)/lg(k,2/ k,1)= E / E, (5)
实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E的值为E, = 8.36—83.6*103 J/mol；而菌体死亡的活化能E芽孢：E = 418*103 J/mol；无芽孢：E = 209—250*103 J/mol。

显然，（5）式的比值〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。

提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。

换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。

通常所说的高温短时灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。

结论1：当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。

要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。

结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。

（二）、影响灭菌效果的因素
（1）微生物种类：不同的微生物k值不同。

（2）初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。

（3）培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。

(4)传热与混合状况：影响受热均匀度。

(5)培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。

(6)蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。

(7)pH：酸性pH下可加快微生物热死速率。