3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐下，发出橙 色荧光
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活 化菌种），37℃过夜培养
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜 培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap）， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）
2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因 此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构， 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒 连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化 质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样）
DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线
状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热
或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA
容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和
回到中性pH时即恢复其天然构象
注意
• EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应 带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该 染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的 器皿或物品，必须进行清洗或弃去
5.加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一 Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置510min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把 Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心， 倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 9.50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存）
二
质粒提取
1. 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中， 12000r/min，4℃，30sec 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中， 剧烈振荡 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物， 将Eppendorf管放在冰上
酶切鉴定
10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶
到一Eppendorf管 37 ℃，1-2h 加2μL的反应中止液。 电泳： 1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照
思考题
染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？
参考答案
纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于
纯化的技术和实验要求
碱裂解法
基本原理：
1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋
白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质
粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复 性而呈絮状，离心时可沉淀下来
质粒DNA的提取和鉴定
目的
•
•
掌握碱裂解法提取质粒的方法
了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析 法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 • 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培 养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒 DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)