大肠杆菌感受态细胞的制备、 大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选 的转化、 重组 的转化
1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术以及筛选转化体的技 术。了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义。 生物学研究中的意义。
冰冷的0.1mo1／ （6）弃去上清液，加入 ）弃去上清液，加入100µl冰冷的 冰冷的 ／ L CaCl2溶液 ， 小心悬浮细胞 ， 冰上放置片刻 溶液，小心悬浮细胞， 即制成了感受态细胞悬液； 后，即制成了感受态细胞悬液； （ 7） 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 ） 化实验，也可加入占总体积15％ 化实验，也可加入占总体积 ％左右高压灭菌 过的甘油， 混匀后分装于1.5ml离心管中 ， 置 离心管中， 过的甘油 ， 混匀后分装于 离心管中 于-70℃条件下，可保存半年至一年。 ℃条件下，可保存半年至一年。
(2) 将以上各样品轻轻摇匀 ， 冰上放置 将以上各样品轻轻摇匀， 冰上放置2030min， 于 42℃ 水浴中保温 － 2min， 然后 ， ℃ 水浴中保温1－ ， 迅速冰上冷却2min 迅速冰上冷却 (3) 立即向上述管中分别加入 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体 液体 培养基（ 不需在冰上操作） 培养基 （ 不需在冰上操作 ） ， 使总体积到 0.5ml， 该溶液称为转化反应原液 ， 摇匀后 ， 该溶液称为转化反应原液， 于37℃振荡培养约 ℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复 正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因 正常生长状态， 产物(Ampr)。 产物 。
4) 检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数， 统计每个培养皿中的菌落数，各实验组 培养皿内菌落生长状况应如表所示: 培养皿内菌落生长状况应如表所示
各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析
组 转化实验组 含抗菌素的平板 白色菌落和少量 蓝色菌落 无菌落或极少量 白色菌落 蓝色菌落 结果说明 说明有重组质粒导入细 胞中（ 胞中（有时还需要酶切 进一步鉴定〕 进一步鉴定〕 说明插入片段比较纯或 有少量模板DNA存在 有少量模板DNA存在 可以判断感受态细胞的 效率
3) 平板培养（有时需要稀释） 平板培养（有时需要稀释）
(1)取各样品培养液 取各样品培养液0.1ml，分别接种于 取各样品培养液 ， 含抗菌素LB 平板培养基上 ， 涂匀 含抗菌素 如果用玻璃棒涂抹， （ 如果用玻璃棒涂抹 ， 酒精灯烧过 后稍微凉一下再用，不要过烫） 后稍微凉一下再用，不要过烫）。
重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、 进行酶切分析、 互补、小规模制备质粒 进行酶切分析 插入失活、 以及杂交筛选的方法。 插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最 以及杂交筛选的方法 常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶 常用的方法是小规模制备质粒 进行酶 切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以 切分析，对于带有 基因的载体还可以 结合α 互补现象来筛选 互补现象来筛选。 结合α-互补现象来筛选。
由互补产生的β 半乳糖苷酶( Z)能够作 由互补产生的β－半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5 吲哚－ 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－ 半乳糖苷(X gal)而产生蓝色的菌落 (X而产生蓝色的菌落， D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所 以利用这个特点， 以利用这个特点，在载体的该基因编码序列 之间人工放入一个多克隆位点， 之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个 外源DNA片段时， DNA片段时 Z(α 基因的失活， 外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活， 破坏α 互补作用 就不能产生具有活性的酶。 互补作用， 破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。 所以，有重组质粒的菌落为白色， 所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重 组质粒的菌落为蓝色。 组质粒的菌落为蓝色。
转化（transformation）： 转化（ ） 是将异源DNA分子引入一细胞株系， 使受体细 分子引入一细胞株系， 是将异源 分子引入一细胞株系 胞获得新的遗传性状的一种手段， 胞获得新的遗传性状的一种手段 ， 是基因工程 等研究领域的基本实验技术。 等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现 分子通过复制表达， 进入细胞的 分子通过复制表达 遗传信息的转移， 遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 转化过程所用的受体细胞一般是限制－ 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修 饰系统缺陷的变异株， 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。 甲基化酶的突变株。
转化的方法： 转化的方法： 1. 化学的方法 热击法)；使用化学试剂（如 化学的方法(热击法 ；使用化学试剂（ 热击法 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处 ）制备的感受态细胞， 理将载体DNA分子导入受体细胞； 分子导入受体细胞； 理将载体 分子导入受体细胞 2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 电转化法： 感受态细胞， 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。 分子导入受体细胞。 分子导入受体细胞
克隆的筛选： 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。 主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等； 氯霉素、四环素、链霉素等；
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则， 分子的受体细胞。 即带有异源 分子的受体细胞 否则， 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上， 的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的 菌落， 质粒。 质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖， 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖， 但对于连接混合物而言， 但对于连接混合物而言，此时并不能确定 哪个克隆含有插入片段。 哪个克隆含有插入片段。
பைடு நூலகம்
重组DNA转化细菌过 重组DNA转化细菌过 DNA 程示意图
3．仪器、材料和试剂 ．仪器、
无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计， 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心 移液器，微型离心管等； 机，移液器，微型离心管等； 菌株： DH5 菌株：E.coli DH5α 质粒： 质粒：pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以 空质粒； 及pBluscript KS 空质粒； LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基 LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉 培养基 LB平板培养基（ 浓度50 100µg mL， 5020- 48µg/ml, 素 ， 浓度 50 - 100 g ／ mL ， X - gal 20 - 48 g/ml, g/ml。 IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG g/ml 一般将抗生素、 gal和 配制成1000 储备液， 1000× 配制成 1000 × 储备液 ， 用时按培养基的量再加 入）； 预冷CaCl 溶液（ mol／ 预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）
转入2ml离心管 （ 2）每组取培养液 个 2ml转入 ） 每组取培养液3个 转入 离心管 在冰上冷却20-30min， 于 4℃ ， 4000r 中 ， 在冰上冷却 ， ℃ 离心10min（从这一步开始 ， 所有操 ／ min离心 离心 （ 从这一步开始， 作均在冰上进行，速度尽量快而稳） 作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； 溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； ／ 离心10min； （4）0～4℃，4000r／min离心 ） ～ ℃ ／ 离心 ； （5）弃去上清液，加入500µl冰冷的 0.1mo1／ L CaCl2溶液 ， 小心悬浮细胞 。 溶液， ／ 溶液 小心悬浮细胞。 0～4℃，4000r／min离心 离心10min； ～ ℃ ／ 离心 ；
2）细胞转化 ）
(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液 如是冷 分别取 个 感受态细胞悬液(如是冷 感受态细胞悬液 冻保存液， 冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操 重组质粒DNA(体 作)，第一组，加入 µl重组质粒 ，第一组，加入10 重组质粒 体 积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞，此管为 感受态细胞， 积不超过 感受态细胞 转化实验组。第二组，插入DNA片段对照 转化实验组。第二组，插入 片段对照 组，即酶切后DNA片段 即酶切后 片段25ng+100µl感受态 感受态 片段 细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即 对照组， 细胞悬液；第三组，质粒 对照组 1ng 未酶切 未酶切pBluescript 质粒 质粒DNA十100µl感 十 感 受态细胞悬液。 受态细胞悬液。
(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿， 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿， 小时)， 于37℃恒温培养箱内培养过夜 ℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时 ， 小时 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说， 对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此 时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 法制备的感受态细胞， 用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 产生5× 超螺旋质粒 DNA产生 ×106-2×107个转化菌 产生 × 在实际工作中，每微克有10 落。在实际工作中，每微克有 5以上的转 化菌落足以满足一般的克隆实验。 化菌落足以满足一般的克隆实验。
2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 感受态细胞 受体细胞经过一些特殊方法（ 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl， ， RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 等化学试剂法） 等化学试剂法 的处理后， 通透性发生变化 ， 成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞 (competent cell) 。