电泳 ,约 1h 后 ,loading buffer 条带跑到底 ,便可停止 . ⑸考马斯亮蓝染色 ① 将电泳后的 PAGE 胶取下放入容器中 ,加入 50ml 双蒸水或去离子 水 ,加热至沸腾后停止 ,
继续在脱色摇床上摇动 5min, 弃去水溶液 .
② 加上染色液 ,以浸没胶面为准 ,加热沸腾后保持状态 30-60s, 停止加热后继续在脱色摇床
了暂时性的改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞 （ Compenent cells ）。进入
受体细胞的 DNA 分子通过复制、 表达实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（
Transformant ，即带有异
源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有
但在人工构建的质粒载
体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞
的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态， 以
摄取外源 DNA 。
转化（ Transformation ）是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。 用不同浓度的咪唑洗脱。 因为咪唑和组氨酸都带正电， 可在咪唑逐渐加大浓度的条件 下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
Tris- HCl 1M PH8.0 1000 ⑵ 上样
μ l,NaCl 4M 1000
μ l,Brij 20
μ l,DTT 3 μ l, H2O 18ml.
加 2ml 上清到 Ni 柱中 ,并用 2ml AT buffer 冲洗 .(注意缓慢滴加 )
⑶ 洗脱样品
加上 1ml 的 salt washing buffer 冲洗 ,其配方是 AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100 μl.
(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μＬ移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL 离心管
分子蛋白质不能进入孔内而径直流出 ,因此不同大小的蛋白质得以分离 .6、超速离心： 利用物 质密度的不同 ,经超速离心后 ,分布于不同的液层而分离 .超速离心也可用来测定蛋白质的分
子量 ,蛋白质的分子量与其沉降系数 S 成正比 .
蛋白纯化过程中 ,过完柱子后的上清称为什么 ?
铵、氯化钠、硫酸钠等 .盐析时 ,溶液的 pH 在蛋白质的等电点处效果最好 .凡能与水以任意比
例混合的有机溶剂 ,如乙醇、甲醇、丙酮等 ,均可引起蛋白质沉淀 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2、电泳法 ：蛋白质分子在
高于或低于其 pI 的溶液中带净的负或正电荷 ,因此在电场中可以移动 .电泳迁移率的大小主要
取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小 .3、透析法 ：利用透析袋膜的超滤性质 ,可将大分
-70 ℃冰箱保存。）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从 -70 ℃或 -20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 过多次转接， 及贮存在 4 ℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
经 5×107
个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的
手段， 它是微生物遗传、 分子遗传、 基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的
受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体
（R-,M- ），它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些
特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱 protocol 。。。。 蛋白的纯化 1. 菌液离心 取出三角瓶 ,倒入离心管中 ,离心 (6000rpm,10min,4 ℃ ),离心之后 ,倒去上清 . 2. 细胞重悬 加上 2mL 的 lysis buffer 洗沉淀 ,重悬细胞 . lysis buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200 μNla, cl (4M) 500 μ lD, TT 3 μ l,Brij 100 μ l, PMSF 200 μ l,H2O 19ml,共 20ml 体系 . 3. 初步溶解 加入溶菌酶 20μｌ（ 100mg/ml ）于重悬液中 ,然后冰浴 20min. 再用 1.5ml EP 管分装 . 4. 冷冻
实验材料
(1) 大肠杆菌 DH5α （R- ， M- ， Amp- ） 实验步骤
（一）受体菌的培养
(1) 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 下振荡培养过夜（ 12h 左右）。
α单菌落，接种于 3～ 5mL LB 液体培养基中， 37 ℃
(2) 将该菌种悬液以 1:100 的比例接种， 取 250 μＬ菌液转接到 25mL LB 液体培养基中， 37 ℃ 振荡培养 2～ 3h 至 OD600 ＝ 0.5 左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备
标签：
tr..,Ca..,co.. 分类： 细胞技术 > 感受态细胞 来源：
实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化
实验原理 处于对数生长期的细菌经
CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1) 在 2mL 制备好的感受态细胞中加入 2mL30% 甘油（即 1:1 体积，甘油终浓度 15%）。
(2) 将此感受态细胞分装成每份 200 μ L (1.5mL dorf 管 )，液氮速冻，快速转入 -70 ℃冰箱保
存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：
1）分子大小； 2）溶
解度； 3）电荷； 4）吸附性质； 5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离 .
常见的分离提纯蛋白质的方法有： 1、盐析与有机溶剂沉淀 ：在蛋白质溶液中加入大量中性
盐 ,以破坏蛋白质的胶体性质 ,使蛋白质从溶液中沉淀析出 ,称为盐析 .常用的中性盐有：硫酸
再加上 1ml 的 Imidazole buffer （ AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml
）冲洗 ,洗去非特
异性蛋白。 ⑷ 再洗脱目的蛋白
用 300μｌ的 Elution buffer 冲洗 ,获得所需的特异性蛋白 . Elution buffer 配方： AT buffer
DTT 3 μ l, urea 8M 18ml. 其余 buffer 均用 urea buffer 来配置 .
9.SDS-PAGE 的鉴定 ⑴配胶 (根据此蛋白的大小（ 55KD ） ,配置 12% 的胶 )
下 层 胶 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 层 胶 缓 冲 液 PH8.8
3.75ml,TEMED7 μ l,10%APS75 μ l,ddH2O6.8ml. 上 层 胶 的 配 方 是 : Acr/Bis0.75ml, 上 层 胶 缓 冲 液 PH6.8 1.5ml,TEMED
4 μ l,10%APS37.5 ⑵配置样品
μ l,ddH2O3.75ml.
每管加样品 2μl,5 ×loading buffer 4 μ再l,加 ddH2O 补全 20μｌ体系 . 混合好 loading buffer
和样品后 ,在 100 ℃下煮约 5min, 然后置室温下冷却后上样。
样品 1 ：纯化上清；样品 2 ：纯化沉淀；
对照 1 ：未纯化上清；对照 2 ：未纯化沉淀；对照 3 ：标准甘油激酶 ⑶上样 添加样品 ,上样 20μl,同时加上 Marker,10 μl. ⑷电泳 加上足够的电泳缓冲液 (1 ×),要加在两板内外 ,一定要浸没过板 ,形成电流通路 .调好电压进行
7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.
8. 纯化细胞破碎液的沉淀 用 urea buffer 重悬细胞沉淀 , 在常温温育 1h, 再离心 (12500rpm 1h 4 ℃),收集上清 ,重复上
清纯化步骤 .urea buffer 的配方是 Tris- HCl 1M PH8.0 1000 μl,NaCl 4M 1000 μl, Brij 20 μl,
-HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放
-80.
7. 纯化上清 ⑴ 准备 Ni 柱
在试管中加上空柱 ,缓慢滴加 300μｌ的 Ni 柱于空柱中 ,待其完全沉淀（每 300μｌ树脂液中有
5%Ni-NTA agnose ）。再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱子（大约 1h ）。 AT buffer 配方：