免疫组化法:
1 胰酶消化细胞,收集至离心管;调整样本细胞数为1×106/ml;
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面,置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜,使细胞爬片。
3 吸弃平皿内培养上清,加入新鲜培养基,用无菌培养基洗3次;
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次;
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h;
6 倒置相差显微镜下观察,并划定载玻片上细胞爬片密集区;
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗,4℃冰箱内过夜湿孵。
阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。
8 先暂复温30min,后PBS冲洗载玻片3次;
9 滴加二抗,室温湿孵30min;后PBS冲洗载玻片3次;
10 DAB显色:将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上,室温下孵育3min至载玻片略显黄色;
11 清水充分冲洗载玻片,苏木素复染核3-5min,清水冲洗,盐酸酒精分化20s,清水冲洗,氨水返蓝3min,清水冲洗,后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水,每步骤约2min;
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中,各约15min,中性树脂封片,置于阴凉通风处风干。