毕业论文文献综述生物工程淀粉酶的研究进展1. 淀粉酶简介淀粉酶是催化淀粉、糖原转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，广泛应用于淀粉工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒等行业[1]。

淀粉酶是最早用于工业化生产的酶，迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一[2]。

不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。

常见的淀粉酶可以分为以下几种：α-淀粉酶（EC3.2.l.1），也叫液化酶；β-淀粉酶（EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（EC3，2.1.3），也叫γ -淀粉酶，简称糖化酶（缩写GA或G）：异淀粉酶（EC3.2.1.68）等[3]。

α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降；β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，其产物还原性末端葡萄糖单位碳原子为β构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解α-l，4糖苷键和分支的α-1，6-糖苷键，生成葡萄糖。

异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的α-1，6糖苷键，切下侧枝链[5]。

对淀粉酶的分类和作用机制研究较多，可按来源、产物的旋光度、作用机制等进行分类。

但近年随着酶学性质的研究的发展，对酶的作用机制、方式等研究不断取得新成果，分类学问题出现许多难点。

我国在食品方面研究和应用的微生物酶估计有30多种[6]，其中淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、环糊精生成酶等。

2. 淀粉酶的生产2.1 淀粉酶的来源淀粉酶的来源很广泛，可以来自于植物、动物以及微生物。

大部分的淀粉酶存在于微生物中，微生物中主要的两种淀粉酶为α-淀粉酶及葡糖淀粉酶，此外，主要存在于植物中的β-淀粉酶也存在于少量微生物中。

α-淀粉酶可以从几种细菌、真菌和酵母中分离获得。

但是，由于细菌淀粉酶具有几个比较优良的特性，因此，细菌淀粉酶用的比较多，特别是淀粉液化芽孢杆菌已用于工业化生产[5]。

不像其他的淀粉酶，微生物仅产生少量的β-淀粉酶，有杆菌（假单孢杆菌和梭状芽孢杆菌）等。

葡糖淀粉酶具有多种来源，植物、动物及微生物，但是，商业上所用的葡糖淀粉酶也是来源于微生物，在所有微生物中，真菌是葡糖淀粉酶的主要来源。

2.2 淀粉酶的生产淀粉酶的生产主要有两种方法，即液态发酵和固态发酵。

由于固态发酵具有经济上和工程上的优点，因此人们常常采用这种方法生产淀粉酶。

2.2.1 α-淀粉酶的生产杆菌是α-淀粉酶的最重要的来源而且可以用于酶的生产。

解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以生产耐热的α-淀粉酶，同时也可以进行生产酶及淀粉的水解[5]。

在乳清、玉米浆以及大豆粉的基础上，开发了一些简单而又便宜的培养基用于α-淀粉酶的生产，这种培养基也可以进一步开发成为工业生产α-淀粉酶用的培养基。

一些研究表明，不同的碳源会影响α-淀粉酶的产量，乳糖、葡聚糖及可溶性淀粉有利于酶的产量的提高，当使用葡萄糖时，酶的产量非常高。

溶氧率也是α-淀粉酶发酵生产时的一个重要的因素，高的溶氧率可以产生大量的酶。

丝状真菌是胞外酶的最大的生产者，因此，用这些菌来生产α-淀粉酶也引起人们的兴趣，嗜热真菌是α-淀粉酶最好的生产菌，调节其生长条件和培养基成分，可以使酶的产量增加。

固定化细胞培养技术也用于α-淀粉酶的生产，用这种技术可以极大地提高酶的产量，如将地衣芽孢杆菌固定在膜上，生产的α-淀粉酶比游离细胞产量多176%。

2.2.2 β-淀粉酶的生产如前所述，β-淀粉酶主要来源于植物，因此用微生物生产β-淀粉酶的工作不多。

可以产生β-淀粉酶的微生物有多黏芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、假单胞菌等。

人们用来自于木薯、玉米、土豆、小麦和小麦麸等的废弃淀粉作为底物来生产β-淀粉酶，发现以木萝和小麦麸为底物的β-淀粉酶产量最高；还有人用固定化细胞的方法来生产β-淀粉酶，在所有的方法中，离子化的凝胶作用于β-淀粉酶的生产最有效。

2.2.3 葡糖淀粉酶的生产用黑曲霉以固状培养的方式生产葡糖淀粉酶已作了大量的工作，这些研究包括农副业与工业的废弃物如小麦麸、米糠等对黑曲霉生长和活性的影响，此外，这些物质及湿度还明显地影响酶的生产。

一些细菌和酵母也可以生产葡糖淀粉酶。

发酵罐的设计和结构也影响酶的生产，如栽培木箱36小时所产生的酶的量相当于摇瓶培养96小时所产生的酶的量。

此外，培养方法不同酶的产量也不一样，如分批培养比一次投料的效果更好。

2.3 淀粉酶的纯化和性质运用于医药和治疗的淀粉酶需要更高的纯度，因此，开发出一种经济有效的方法对酶进行纯化从而获得具有活性的化学纯的酶是非常重要的。

传统上，对发酵罐中的淀粉酶的纯化分为几个步骤：培养物的离心、用超滤法获得选择一定浓度的上清液、用硫酸铵或有机溶剂如冷乙醇获得沉淀中的酶、粗制的酶用色谱法和胶过滤纯化。

细菌的α-淀粉酶可以从杆菌中获得，人们已经研究了喜温菌株和耐热菌株的纯化和特性。

一些研究者用硫酸铵沉淀、离子交换色谱和胶过滤法纯化获得了同质的α-淀粉酶，焦碳酸二乙酯可以抑制此酶的活性。

由地衣芽孢杆菌生产的细胞外耐热型α-淀粉酶可以用下面的方法纯化：在乙二醇／葡聚糖系统中做两层分离，然后用胶过滤和离子交换色谱进行纯化[7,8,9]。

细胞外淀粉酶的基本性质反映了细菌所生长环境的酸碱度和温度，如某些碱性杆菌生长于50℃，pH为10.5，其产生的α-淀粉酶的最适温度和pH分别为60℃和pH值11.0～12.0；另一类杆菌生长的最适pH为8.5，所产的α-淀粉酶最适pH为9.0。

在工业化的生产中，人们常常用自动聚焦的纯化技术获得化学纯的淀粉酶，这种方法可以纯化一些枯草芽孢杆菌产生的α-淀粉酶。

此法可以采用大量的起始反应物，可以大量生产α-淀粉酶。

在真菌中，获得纯化的α-淀粉酶仅有很少的一些菌株，因此它们的性质研究也不多。

不同的菌株所产的α-淀粉酶性质不一样[10]。

酵母的α-淀粉酶获得纯化的酵母α-淀粉酶也不多，从隐球酵母生产的可以消化生淀粉的耐热α-淀粉酶的纯化仅用一步方法便可以解决，这种酶与黑曲霉和米曲霉产生的α-淀粉酶性质相似[11]。

从微生物中获得的β-淀粉酶比从植物中获得的β-淀粉酶具有更高的耐热性，β-淀粉酶与α-淀粉酶相比，其最适的pH更高，而且不需要Ca2＋作为酶的稳定剂和提高酶的活性，用硫酸分级分离，离子交换色谱和胶过滤的方法纯化。

Hg2＋、Zn2＋和Cu2＋可以抑制酶的活性，Na＋可以激活酶。

加入支链淀粉酶可以极大地提高酶对生淀粉的降解。

此外，麦芽糖是β-淀粉酶运用于生谷物淀粉的水解产物。

许多菌株产生的葡糖淀粉酶已获得纯化，性质也获得了确定。

总的来说，葡糖淀粉酶的最适pH 为4.5～5.0，最适温度为40～60℃，但也有一些例外，有些酶的最适pH值可达11.0。

商业上从黑曲霉中获得的葡糖淀粉酶制备物中包含有六种类型，其分子大小明显不同，最适的pH值在3.5～5.0之间。

通过纯化根霉产生的葡糖淀粉酶，可以获得两种葡糖淀粉酶，一种酶具有强的脱支链的活性，另一种酶脱支链的能力较强。

此外，还有对生淀粉的吸收和消化能力都特别强。

3. 淀粉酶的研究进展淀粉酶中，尤以α-淀粉酶最为常用，随着社会需求的增大，工业生产对α-淀粉酶的需求量越来越大。

3.1 α-淀粉酶的催化机理目前公认的α-淀粉酶的催化机理[12,13]，催化中心位于α/β桶状结构的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的两个重要残基。

整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体261谷氨酸质子化；第二步，亲核基团231位天冬氨酸亲核攻击葡萄糖残基的C1，糖苷键断裂，葡萄糖残基与231位天冬氨酸形成酯键，同时去质子化状态的261位谷氨酸夺取一个水分子H+，产生一个OH-；第三步，OH- 攻击葡萄糖残基的C1，使酯键断裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢复初始状态。

在已知结构的α-淀粉酶中，在α/β桶状结构的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸两个残基，它们的相对位置相似，并且所有α-淀粉酶的整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近的[13]。

以对α-淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生产中应用是近年来新兴的发展趋势。

3.2 α-淀粉酶的突变研究目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，即随机突变和定点突变，有时也将两种方法结合使用。

随机突变首先需构建突变文库，然后根据研究酶的特点设计高通量的筛选方法。

它的优点是不必明确知道酶的三维结构、催化机理等。

定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。

将这些方法应用于α-淀粉酶的研究已有一定进展。

目前有关突变的研究大多针对于地衣芽胞杆菌活菌，如Takase研究发现天冬酰胺326赖氨酸/天冬氨酸能够显著改变地衣芽胞杆菌活菌的pH特性[14]。

Nielsen J E等对地衣芽胞杆菌活菌进行定点突变，发现谷氨酰胺264丝氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞杆菌活菌的热稳定性。

Shaw A 等[15]通过随机突变，得到Met15Thr，能增强地衣芽胞杆菌活菌的稳定性，在此突变的基础上进行随机突变，发现Met15Thr和天冬酰胺188丝氨酸使地衣芽胞杆菌活菌热稳定性提高2倍[16]。

但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变有待进一步研究。

3.3基因克隆及氨基酸序列分子生物技术的发展，对α-淀粉酶的研究已进入分子水平阶段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，基因工程技术已广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作，主要在大肠杆菌等。

Suganum a 等研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。

Kim 等描述了编码一种新α-淀粉酶的基因，该基因被克隆并在大肠杆菌中表达[17]。

Steyn 和Pretorius 编码α-淀粉酶基因(AMY)编码GA的基因(STA 2)转入一个酵母菌的整合载体(Yip5)，形成重组质粒pSP1和pSP2，AMY和STA 2被一同连接到载体Yip5中，产生质粒pSP3。

随后，编码抗Geneticin 418 显性标记的A PH 1 被克隆到pSP3 中得到pSP4。

为了增强Geneticin 418的表达，pSP4再连接启动子GAL10和终止子URA3，这样就得到质粒pSP5。

pSP5通过增加ARS1H 和CEN4序列被修改成环形微染色体pSP6。

转入了pSP1-pSP6 的实验室郎酒酵母菌株能稳定产多种α-淀粉酶和GA [18]。