实验十四糖化酶活力的测定
一、实验目的
1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。

2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

二、实验原理
糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。

本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。

碘量法定糖原理：
淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：
I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O
NaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI
体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。

I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI
三、仪器、原料和试剂
仪器
吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。

原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。

试剂
1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。

倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。

2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。

3. pH
4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。

取分析纯冰醋酸
5.78毫升定容至1000毫升。

以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。

4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。

5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。

四、操作步骤
1糖化曲制备（以浅盘麸曲为例）
（1）菌种的活化
无菌操作取原试管菌一环接入察氏培养基斜面，或用无菌水稀释法接种，31℃保温培养4~7天，取出，备用。

（2）三角瓶种曲培养
称取一定量的麸皮，加入70%~80%水，搅拌均匀，润料1h，装瓶，料厚约1.0~1.5cm，包扎，在9.8×104Pa压力下灭菌40min。

冷却后接种，31~32℃培养，待瓶内麸皮已结成饼时，进行扣瓶，继续培养3~4天即成熟。

要求成熟种曲孢子稠密、整齐。

（3）糖化曲制备
a配料
称取一定量的麸皮，加入5%稻皮，加入原料量70%水，搅拌均匀。

b蒸料
园气后蒸煮40~60min。

时间过短，料蒸不透对曲质量有影响；过长，麸皮易发粘。

c接种
将蒸料冷却，打散结块，当料冷至40℃时，接入0.25~0.35%（按干料计）三角瓶种曲，搅拌均匀，将其平摊在灭过菌的瓷盘中，料厚约1~2cm。

（4）前期管理
将接种好的料放入培养箱中培养，为防止水分蒸发过快，可在料面上覆盖灭菌纱布。

这段时间为孢子膨胀发芽期，料醅不发热，控制温度30℃左右。

约8~10h，孢子已发芽，开始蔓延菌丝，控制品温32~35℃。

若温度过高，则水分蒸发过快，影响菌丝生长（5）中期管理
这时菌丝生长旺盛，呼吸作用较强，放热量大，品温迅速上升。

应控制品温不超过
35~37℃。

（6）后期管理
这阶段菌丝生长缓慢，故放出热量少，品温开始下降，应降低湿度，提高培养温度，将品温提高到37~38℃，以利于水分排除。

这是制曲很重要的排潮阶段，对酶的形成和成品曲的保存都很重要。

出曲水分应控制在25%以下。

总培养时间约24h左右。

（7）糖化曲感官鉴定
要求菌丝粗壮浓密，无干皮或“夹心”，没有怪味或酸味，曲呈米黄色，孢子尚未形成，有曲清香味，曲块结实。

2. 糖化酶活力测定
（1）浸出液的制备
称取5.0g固体曲（干重），置入250ml烧杯中，加90ml水和10ml pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，于40℃水浴中保温1h，每隔15min搅拌一次。

用脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲浸出液。

（2）糖化酶活力的测定
取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)准确计时1小时。

取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。

取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L 碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。

加入2N硫酸2毫升。

用0.05硫代硫酸钠滴定至无色。

其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。

五、计算：
A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；
B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；
90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；
V1—酶液的体积(2毫升)；
V2—反应液总体积(32.20豪升)；
V3—吸取反应液样品体积(5毫升)；
N—酶液稀释倍数；
N—Na2S2O3的当量浓度(0.01mol/L)。

六、结果
1. 记录制曲过程中观察到的现象。

2. 酶活力测定结果列表记录。

七、思考题
1. 固体曲和液体曲相比，各有何优缺点？
2 糖化酶活力测定中应注意哪些因素？。