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• 分子结构
（１）在其手性原子上均具有两个环状取代基 或环内含有手性碳原子，而不能拆分的化合物 在其手性碳原子上只含有一个环状取代基。
（２）空间效应对手性识别的影响更为显著。
（３）环糊精浓度增加有利于手性分离，但 β-环糊精溶解度受限制。
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手性流动相HPLC法拆分萘普生对映体
外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！
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对映体与生物大分子的三点作用
d
c
a
b
d
a
b
c
手性分子的a、b、c三个 基团与受体分子的活性作 用点、、 结合，是高 活性对映体（优映体）。
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手性分子的a、b、c三个基 团中只有a和b与受体分子的 活性作用点和结合，是 低活性对映体（劣映体）。
流速为0.5 ml/min；紫外检测波长为259 nm； • 柱温为25℃；进样体积为20 μl。
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• 环糊精类（包容色谱 ）
D-葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接的环状 分子结构 ，其疏水性内腔的包容作用和腔外上 的羟基与药物对映体的氢键作用是手性识别的 基础。
有α、β、γ三种类型，其中β环糊精及其衍 生物应用范围最为广泛。
前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50 μl该溶 液，加入50 μl含2 g/L GITC的乙腈溶液，混合均匀
后室温下放置10 min ~ 30 min，进样分析。
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拉贝洛尔的GITC衍生化
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不同结构的药物衍生化策略
• 胺基类手性药物 ：运用异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC） 类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲 酸酯、脲、硫脲和磺酰胺 。
• 将手性试剂加到流动相中，利用下面两种方式 实现拆分：
① 流动相中手性试剂与对映体形成非对映体配 合物，在固定相中的保留时间和分配不同而得 到拆分；
② 手性试剂吸附在柱上形成动态的手性固定相， 对映异构体与之作用不同而得到拆分。
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环糊精手性固定相与流动相
• 流动相添加环糊精法拆分时，与流动相中环糊精 包合越好的对映体，随流动相较快地被洗脱；
• 如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强， 左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的 一半。
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手性拆分（Chiral resolution）
• 对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理 化性质完全相同，因而分离难度大。
• 手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境， 构造非对映异构体，使药物对映体间呈现理化 特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。
在未研究清楚两种单一对映体之间的生物 学差异时，以消旋体给药往往会影响药物 质量，甚至会严重损害人体健康。
“反应停”(Thalidomide)作为人工合成药， 当时投入使用时是两种对映体的混合物。
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反应停：五十年恩怨
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手性药物的现状
临床药物 1850种
天然和半 合成药物 523种
分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。
根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的 等量混合物称之为消旋体。
COOH
COOH
OH
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HH CH3
CH3 OH
手性异构体在药理学效应上的差异 • Pfeiffer规则：
对映异构体之间的生物活性存在着差异； 不同的对映体之间活性的差异是不同的； 当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越 高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。
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多糖及其衍生物类手性固定相
• 纤维素的单体D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键相 连而成的线型聚合物，将羟基衍生化 成 酯以增强手性识别能力。
• 由于水和卤代烃都能溶解纤维素及其衍
生物，故流动相大都为正相色谱系统，
使用极性较小的非卤代烃有机溶剂。
OH
OH
*
O
O OH
**
*
OH *
*
OH *
CHIRALPAK
AS系列
直链淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]衍生物 ；适合于分离β-内酰胺类、环氧化物、酸类、 杂环类化合物化合物。
纤维素-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]衍生物； CHIRALCEL 适用于分离β-受体阻滞剂、具有相同功能的化
OD系列 合物、类固醇类化合物，如：阿普罗尔、美 托洛尔、氧烯洛尔。（芳氧丙醇胺类）
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GITC衍生化分离胺类对映异构体
• 反应原理
OAc AcO
AcO
O NCS
OAc
NHR R1 R2
OAc
AcO AcO
O
S R R1
NH C N
OAc
R2
• 在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二 氯甲烷或DMF中进行。
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色谱分离和前处理条件优化
• 流动相组成和流动相pH对拆分的影响
• 在CSP表面所形成的非对映体对，可根据其稳 定常数不同而获得分离。（三点结合模型）
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“三点相互作用 ”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发 生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个 必须是立体化学相互作用。
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相 关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只 能两点作用形成不稳定状态。
（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；
（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。
• 衍生化时间及GITC用量的优化
（1）反应时间：10 min ~ 30 min （2）用量：过量两倍
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手性拆分结果
色谱条件： C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙 二氨四乙酸TEAA 缓冲（pH = 5.5），检测波长254 nm； 1 ml/min。
OH
O
*
**
O
*
O OH
O
**
*
OH *
*
OH *
OH
O
*
**
O
O
OH
OH
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纤维素固定相手性识别作用
手性中心附近带有羰基的外消旋化合物与纤 维素衍生物通过偶极－偶极作用，带有羧基 、羟基或氨基的外消旋化合物通过氢键发生 手性识别作用。
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• 直链淀粉是D-葡萄糖以α-1,4-糖苷键相连 而成的线型聚合物，和纤维素的手性识 别能力的不同，主要在于其葡萄糖单元 的构象差异。
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异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类
• 常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙 酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC） 。
• 与大多数醇类和胺类化合物反应，形成相应氨基甲酸 酯或脲的非对映异构体。
• 广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素 类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。
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色谱分离和前处理条件优化
• 有机相对拆分的影响
（1）相比于乙腈，乙醇可以使保留时间缩短； （2）随着乙醇体积分数的逐渐增大，其容量因子呈逐步减
小的趋势，分离因子和分离度也减小。
• 流动相中HP-β-CD浓度的优化
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手性试剂衍生化法（CDR）
• 原理： 光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂
于柱前衍生化，在药物对映体中引入另外一个 手性，形成非对映异构体，再以HPLC分析。
(R) SA (R) SE (R) SA
(R)
SE
(S)
SA
(R)
SE
(S)
SA
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手性反应注意事项
• 手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好： 异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类：氨基酸 羧酸衍生物：胺类、醇类 胺类：羧基化合物。
• 手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2） 醇基（-OH），羧基（-COOH），以保证与CDR反应 完全 ；
• 生成的非对映体光学稳定，柱效源自高，能有效检测。CH3*
COOH
H3CO
优化的流动相添加剂： (a) L-脯氨酸、 (b) β-环糊精（β-CD）、 (e)羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD） (c、d)甲基-β-环糊精（Me-β-CD）
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• 流动相体系：乙醇∶水相（不同手性添 加剂，1%三乙胺水溶液，pH为4.4）；
HP-β-CD比甲基-β-CD拆分效果好
• 羧基类手性药物 ：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化 为酯和酰胺 。
• 醇类手性药物 ：运用手性酰氯、磺酰氯类试剂 ，将其衍生 化成酯 。
• 烯类手性药物 ：衍生化成水性铂复合物 。
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手性固定相法（CSP）
• 原理：将手性试剂化学键合到固定相上与药物 对映体反应形成暂时的非对映体对复合物，这 种固定相称作CSP。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越
大。
Y为S性手性选择剂，X为外消旋体
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手性固定相
吸附型 蛋白质类
多糖衍生物 环糊精类
反相、防有机 溶剂
正相、防水
正、反相均可
电荷转移型
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蛋白质类手性固定相
• 将蛋白质固定到硅胶上，利用蛋白质分子结构 中的L-氨基酸提供手性作用位点与手性药物对 映体产生不同的氢键作用、静电作用、疏水作 用、离子对作用等达到手性拆分。
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最常用的多糖型手性色谱柱 （Daicel ，大赛璐 ）
• 淀粉柱：Chiralpak AD、Chiralpak AS、 • 纤维素柱：Chiralcel OD、Chiralcel OJ