A = log ( Io ) = a b c I
分离色谱柱
色谱柱时色谱分析的核心
• 分离就是发生在色谱柱上 • 热力学因素
– 分离物资与固定相相互作用机理 – 填料的设计、合成与选择 – 理论塔板数：Martin & Synge,
1941 • 动力学因素
– 分离过程中操作参数对分离的影 响
– 速率理论：Van Deemter,紫外吸收 按选择性分类 • 选择性检测器：紫外检测器、荧光检测器、电导检测器 • 通用性检测器：示差折光检测器
紫外-可见波长检测器
应用范围最广泛的检测器 • 大约占使用的70% • 紫外光区：190~370nm；可见光区：370~700nm
紫外-可见波长检测器工作原理
朗伯-比尔定律：
上样(load)状态
进样(inject)状态
手动进样阀的进样
load位置
inject位置
注意：一定使用平头微量进样针
六通阀工作流程
进 样—进 样 量
•全定量环进样 准确，但浪费样品 至少需要2.5倍进样体积的样品 •部分定量环进样 进样量 < 进样环体积的一半 无层流效应的影响 误差来源于进样针及操作人员 使用内标法将可以提高进样的准确度
• 实验后以强溶剂清洗色谱柱 • 对未知样品可经梯度找到适当的等度条件
溶剂输出泵
溶剂输出泵—往复泵
工作过程：电机带动偏心轮，驱动活塞往复运动 在高压下连续以恒定的流量输送液体
优点：溶剂不受限制 死体积小 溶剂混合均匀
缺点：会产生脉冲 需增加脉冲阻尼器
往复泵的工作原理
溶剂进入 活塞收回、腔内形成低压 入口阀打开，出口阀感应压差而闭和
HPLC用水
HPLC用水
HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱 的洗脱。 超纯水电导率>18 MΩ·cm）。 HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用作空白，在 190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过 0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典 纯水≤10ppm）。
色谱柱形态
半制备 标准分析 窄径柱 微径柱
ID (mm)
8-20 4.6 2.0 1.0
Load (mg)
10-50 1 0.2
0.05
流速(ml/min)
5-30 1 0.2
0/05
柱温箱
检测器分类
按检测对象分类 • 整体性检测器：检测流动相的总体物理性质
如：示差折光检测器、电导检测器 灵敏度低、易受温度影响的波动、不适合梯度洗脱 • 溶质性检测器：测量溶质的某种特性或物化性质的变化 如：紫外检测器、荧光检测器
除气方法： • 超声脱气
流动相的准备—除气
• 氦气脱气 • 在线真空脱气
G1322A 标准真空脱气机
等度洗脱
等度洗脱不能完全分离样品
• 某些样品太复杂 • 较早洗脱出的色谱峰分离度太差 • 较晚洗脱出的色谱峰变宽或拖尾 • 考虑梯度洗脱
梯度洗脱
梯度洗脱时流动相强度随溶剂组成的改变而增强
• 梯度洗脱广泛适用于许多复杂样品与生物、聚 合物样品的分离
避免死体积、漏夜或损坏柱子
• 使用正确的接头 • 尽可能缩短连接管路长度、降低柱外效应 • 管路切口必須平整 • 在接上色谱柱前先将管路中的气泡赶净
色谱柱安装的方向性
• 接头不可拧太紧 • 打开输液泵、检查柱是否漏
色谱柱选择
除固定相选择外，还要考虑
• 内径、柱长、填料粒径
色谱柱内径
• 柱容量随柱内径增加而增加 • 小内径色谱柱柱效高，省溶剂
流动相的准备
配置流动相 • 混合、过滤、除气
溶剂的混合 • 每一组成的溶剂在混合前必须分 开测量体积再混合 • 两种溶剂混合后的体积通常不是 分开体积的总和
流动相的准备—过滤
将流动相中的颗粒除去
• 细小颗粒会阻塞色谱柱 • 影响泵的使用 • 影响检测器流通池
储液瓶加盖 溶剂进口加过滤头 加预柱保护色谱柱
高效液相色谱演示实验
石向群
九江学院分析测试中心
双黄连胶囊黄苓苷含量测定色谱条件
1、色谱仪器：Varian HPLC，配有ProStar230泵、 ProStar325UV检测器、手动进样器和柱温箱。 2、色谱工作站：Star6.4 HPLC Workstation 英文版 3、色谱柱：Varian C18柱(5μm，4.6mm×150mm)。 4、流动相：甲醇:水:冰醋酸=（50：50：1）。 5、检测波长：274nm，采样时间15min。 6、柱温：25℃ 7、对照品：黄苓苷；样品：双黄连胶囊。
液相色谱基本理论
液相色谱基本概论定义公式
液相色谱仪硬件
液相色谱仪器结构组成示意图
液相色谱仪器组成
溶剂传输系统（泵系统）
进样系统
工作站
组分收集（选相）
检测器
流动相导论
溶剂系统
• 可以是一种或多种水溶液 或有机溶剂 • 携带样品流经色谱柱至检测器 • 当与样品发生相互作用时，样品则发生分离
流动相： 甲醇：水：冰醋酸=（50：50：1）
溶剂输出 活塞推出、腔内压力增加 出口阀打开，入口阀感应压差而 闭和
单向阀的特点： 密封性能相当好 可以非常敏感地感应压差而迅速闭和
多元泵Prostar230
低压比例分配，高压/低压 梯度混合
• 適合開發應用在複雜移動相混合方法 • 多溶劑依比例閥快速切換而準確混合 • 一般入口單向閥感應開啟的壓力<1atm • 短暫的壓力降造成氣泡問題
如何解決氣泡問題
• 在線脫氣：效能隨時間變差 • 吹氦脫氣：成本高 • 瓦里安的專利方法
多元梯度，比例阀混合
• 三个微电子处理器控制比例阀 • 溶剂比例依%ABC编程控制 • 进入75ul混合腔内混合 • 有相当精确的混合比例控制
脉冲
•单活塞往复泵脉冲特点 正弦波 必须加脉冲阻尼器
•输液泵流速调节 进液速度固定在200毫秒 输液速度较慢 调节输液速度，从而改变流速 当流速为1ml/min时，输液速度为4.3秒
脉冲阻尼器
作用：消除输液泵造成的脉冲 瓦里安的设计
体积700ul的U型管 内管为弹性材料制成 外部以脱气、可压缩的液体包围 输液时 压力增加，弹力管膨胀 能量储存于液腔内 进液时 能量传递至管内，维持流速恒定
手动进样阀
•六通阀设计 耐高压，低死体积 可以手动或自动旋转进样阀 自动进样的重复性优于手动进样