诱变物质的微核检测技术
一．实验目的
1.了解微核检测的方法和意义
2.通过检测评价环境中常见物质的诱变情况
3.锻炼自主设计实验的能力
二．实验原理
微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。

微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。

微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。

微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。

微核的形成原理
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。

有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。

这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。

当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。

第一、二次减数分裂后期的落后染色体，将在末期形成微核
第一次减数分裂末期，落后染色体和片段形成微核
引起染色体断裂的理化因素：
物理因素：具有能量的各种射线均可以作用于DNA导致链的断裂，如α射线，β射线，γ射线，X-ray ，中子，质子，UV
化学因素：许多诱变剂和重金属都可能引起染色体畸变，如环磷酰胺，氧化铬CrO3，叠氮化钠NaN3，甲级磺酸乙酯EMS，硫酸二乙酯
通常染色体断裂之后有三条发展途径：1，两个断裂端重新愈合回复到原来的染色体结构。

2，断裂的连接修复发生错误，产生染色体变异：缺失，重复，倒位，异位等。

3断裂的染色体不愈合，细胞分裂时形成微核，最后丢失。

微核细胞率
含有微核的细胞数占观察细胞总数的比率称为微核细胞率（千分率），简称微核率。

①微核细胞率可以用来反映遗传物质受损伤的程度；②在一定的剂量范围内，微核率与环境因子的剂量呈正相关③人们常用微核率来反映环境中有害毒物的污染程度：一般认为，微核率在10‰以下时无污染，为环境本底；10-18‰时，有轻度污染；18-30‰时，有中度污染；＞30‰，有重度污染。

微核技术应用
由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。

只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。

目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中，大大拓展
了微核试验的检测和应用范围，已发展成为能同时检测染色体断裂、丢
失、分裂延迟、分裂不平衡、基因扩增、不分离、DNA损伤修复障碍、
HPrt基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传学终点的检测，因而
近年来国际上有人提出了新微核试验(newmi一cronucleustest)概念田，
从而大大拓展了微核试验的应用范围。

当然，要实现一个实验多个遗传
损害终点的检测，需要更多的新的技术手段配合，如FISH技术、图象分
析卜技术等等。

微核监测的关键：
1.材料的选择材料应选择染色体条数少，个体大，便于统计，对
污染物反应比较敏感的材料；这种材料还应适宜于在当地生长。

2.样品的处理
a)不同药剂处理的同一植物，当它们达到产生微核的峰值后，由于
长时间处理所诱发的微核数之间的差异会变得不显著。

b)同一处理，同一剂量下短时间处理能达到微核的峰值，长时间处
理仍只能得到相似的峰值微核值的趋势。

因此应通过试验找出最
佳处理时间，这样不仅可大大缩短实验周期，而且可使实验结果
更加明显、可靠。

3.微核率的统计
微核的识别标准：①凡主核大小的三分之一以下的小核；②小核着色
不论深浅；③小核形态可以是圆形，椭圆形，不规则形；④小核可以
与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓楞楚的
都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心(Chromocenter)当作微
核计入。

微核率（MCN‰）=测试样品（或对照）观察到的微核个数/测试样品（或对照）观察细胞总数×1000‰
三．实验用品
1.材料：大蒜
2.实验器具：显微镜，载玻片，盖玻片，刀片，吸水纸，镊子
3.药品：卡诺固定液，1MHCl, 改良苯酚品红，水，洗洁精，烟丝，NaN3四．实验步骤
1.取材
2.处理各实验组
3.恢复培养24小时
4.卡诺固定液中固定24小时，如不立即检测可移至70%乙醇中4℃下保
存
5.制片
①根尖用1MHCl处理的10min,水洗3次。

②切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10 min。

③压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。

6.镜检
每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即
为该处理的微核千分率。

五．结果与分析
微核率（MCN‰）组别被检测液1000个细胞
中的微核数
2 叠氮化钠47 47‰
3 烟丝16 16‰
4 洗洁精 2 2‰
1000 1000‰
5 100%蓝月亮洗衣
液
6 80%蓝月亮洗衣液1000 1000‰
7 60%蓝月亮洗衣液1000 1000‰
8 40%蓝月亮洗衣液1000 1000‰
9 20%蓝月亮洗衣液1000 1000‰
10 10%蓝月亮洗衣液1000 1000‰
由实验结果可知，水微核率为0‰，无污染；叠氮化钠微核率为47‰，为重度污
染；烟丝为16‰，为轻度污染；洗洁精为2‰，无污染，为环境本底；蓝月亮洗衣液100%，80%，60%，40%，20%，10%微核率都为1000‰，为重度污染。

对比本班其他组的蓝月亮洗衣液的梯度，当蓝月亮洗衣液稀释倍数为200倍以上时，并没有发生微核。

图1.用NaN3处理的大蒜根尖细胞中的微核
如图1所示，图中主核周围有一个小的小核，即微核。

六. 实验注意事项
1. 用清水将大蒜发根时，大蒜要直立于清水中，使根直立生长。

2. 若测得的诱变剂的诱变的微核过多，可适当稀释诱变剂，再进行微核检测
3.切根时，要切1mm左右，避免过多，否则所做的装片中有伸长区细胞，导致实验统计得到的微核率过低，因为伸长区的细胞不进行有丝分裂，不产生微核。

4. 统计微核数时候，一个细胞核周围若出现了多个微核，算为一个微核。

七. 实验小结
本实验设计阶段本打算检测酸雨以及麻辣烫所产生的微核数，但是由于条件限制，没能找到所需的实验试剂。

酸雨对我们国家每年都造成重大损失，我们希望能够以此为实验材料。

至于麻辣烫，街头有很多，我们认为以此为实验材料进行试验，也是对人们饮食健康的关注。

在实验进行中，蓝月亮洗衣液那一组的梯度设计，由于蓝月亮洗衣液的浓度过大，导致微核率为1000‰，看不出浓度对微核率的影响，应该继续增大稀释的倍数。