大肠杆菌基因组DNA得提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、实验原理提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。

在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。

用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。

为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。

CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器1)实验材料:大肠杆菌2)实验试剂:LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,去离子水。

(搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、)2)TE缓冲液:1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解)1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用)TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20℃备用)4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到65℃使之溶解,然后室温保存)4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。

2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。

5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。

6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp离心10min8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心10min9、取上清液,加入300ul得异丙醇,颠倒混匀,室温下静止10min,沉淀DNA,5000rmp离心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min11、弃上清液,待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中,20℃保存。

二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。

细菌基因组DNA提取试剂盒:1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP30202 50次 420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa DV810A 50 650元3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒GD241101 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD241102 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50次 400元BSC12M1 100次 750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D335000 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 5 210元D335001 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 50 980 元D335002 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 200 3350元荧光定量PCR试验(标准曲线法) 定量实验就是一种实时实验,用于在聚合酶链反应(PCR) 得每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 (靶)数量。

其中靶可以就是 DNA、 cDNA 或 RNA。

【实验原理】在实时定量实验中,反应就是在PCR 产物得扩增达到固定荧光水平时得循环期间时间点来描述得,而不就是在固定循环次数后累积得PCR 产物最终数量来描述。

扩增曲线以图形形式显示在执行得循环次数中检测到得荧光。

在PCR 得最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。

该预定义得PCR 循环范围称为基线。

首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度(与基线循环相对应得 Rn 值)得数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。

然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 ( delta Rn [∆Rn] 值)与阈值交叉得点。

∆Rn 值与阈值交叉得分数循环定义为 CT。

一、试验设计使用StepOne软件中得Design Wizard(设计导向)创建新实验1、定义实验属性在Experiment Properties (实验属性)屏幕上,输入实验得标识信息,然后选择要设计得实验类型。

1)Experiment Name (实验名称)。

2)Barcode (条码),然后输入您得 PCR 反应板上得条码。

(可不填)3)User Name (用户名)。

4)ments (注释)。

(可不填)5)选择Quantitation (定量)实验类型6)Next> (下一步)2、定义方法与材料在Methods & Materials (方法与材料)屏幕上,选择用于实验得定量方法、试剂、升降温速度与 PCR 模板。

1)将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。

将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。

标准曲线实验确定样本中靶序列得绝对量。

从已知量得稀释序列中构建得标准曲线用于归档结果。

当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品与样本。

用于标准曲线实验得 PCR 反应包括以下组分:• 样本－其中靶数量未知得样本。

• 标准品－数量已知得样本。

• 标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线得标准品稀释液 (例如,1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32) 。

• 重复数－含有相同组分与量得相同反应数。

• 阴性对照－含有水或缓冲液得样本,不含模板;也称为“无模板对照(NTC)”。

阴性对照应不会扩增。

2)为试剂选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂)(包括两个引物一个探针) 。

–如果使用TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂) 。

TaqMan 试剂包括两个引物与一个TaqMan® 探针。

引物设计用于扩增靶。

TaqMan 探针设计用于杂交靶,并在扩增靶时产生荧光信号。

切记！Applied Biosystems 不建议将TAMRATM 染料随StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。

–如果使用SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择SYBR® Green Reagents ( SYBR Green 试剂)。

SYBR Green 试剂包括两个引物与SYBR Green 染料。

引物设计用于扩增靶。

SYBR Green 染料可在结合到双链DNA 时产生荧光信号。

SYBR Green 染料通常就是添加到反应得SYBR Green 母液得一部分。

如果使用SYBR Green 染料:选择Include Melt Curve (包括解链曲线)以执行扩增靶得解链曲线分析。

将Standard (标准)选为升降温速度。

Applied Biosystems 不提供SYBR Green 试剂得 Fast 母液。

3)为升降温速度选择Standard (~2 hours to plete a run) (标准 (约两小时完成运行)) 。

–如果为PCR 反应使用Fast 试剂,则选择Fast (~40 Minutes to plete a Run) (快速 (约 40 分钟完成运行) )。

–如果为 PCR 反应使用标准试剂 (包括 SYBR Green 试剂与 TaqMan 试剂) ,则选择Standard (~2 Hours to plete a Run) (标准 (约 2 小时完成运行)) 。

4)为模板类型选择gDNA (genomic DNA) ( gDNA (基因组 DNA) ) 。

5)Next> (下一步) 。

3、设置靶在 Targets (靶)屏幕上,输入您想在 PCR 反应板中定量得靶数量,然后为每个靶设置检测。

1)单击How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (您想在反应板中定量多少靶？)字段,然后输入1(根据需要填)。

注意: 靶检测表中得行数将以您输入得数字更新。

2)选择Set Up Standards (设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。

建议反应板中得每个靶检测设置一条标准曲线。

注意: Set Up Standards (设置标准品)复选框默认情况下已选取。

3)设置靶 1 检测:a、单击Enter Target Name (输入靶名称)单元格,然后输入RNase P(示例)。

b、从 Reporter (报告基团)下拉菜单中,选择FAM (默认) 。

–如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得5′ 端,则选择FAM。