５９２ · 中国药事２００５年第１９卷第１０期 药品中防腐剂的抗菌效力测定与评价 熊家娟（阿斯利康制药有限公司，江苏无锡２１４０２９） 中图分类号：Ｒ９７９．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—７７７７（２００５）１０—０５９２—０３ 为了保证药品的安全性和有效性，药品必须符 合相应的卫生学要求。但有些药品的有效组分没有 足够的抗菌防腐能力，在这些成品制剂中则往往需 要加入适当的防腐剂以有效控制微生物的生长。然 而，防腐剂的抑菌效果往往会受到多个因素的干 扰，如防腐剂的化学结构及其浓度、药品有效组分 的物理和化学特性、制剂形式、包装材料（容器及 其密封件）以及存贮条件等；并且所有的防腐剂都 是有毒物质，因此就临床用药的安全性而言，在药 品制剂的质量标准中制订防腐剂的含量测定和效力 测定是非常重要的。Ｉ】 本文结合美国和欧洲药典 最新版，详细介绍了药品抗菌防腐效力试验的试验 方法，包括检测对象的细致分类和试验用菌悬液的 制备，并分析了两部药典中对防腐剂抗菌防腐效力 的合格标准的异同点。 １进行抗菌防腐效力测试的药品分类 药品的微生物学质量控制要求主要是依据给药 途径而确定的。同样，药品的防腐效力要求也取决 于其给药途径。表１综合了美国药典和欧洲药典对 抗菌防腐效力试验的药品分类。
表１ 抗茵防腐效力测试的药品分类 － 药品类别 品种概述 Ｉ 注射剂，其它以水溶液为介质或载体的肠外用药品 （乳化剂、耳科用药、无菌鼻科用药和眼科用药等） Ⅱ 局部用水性制剂、非无菌鼻科药品．非无菌乳剂类
产品，还包括黏膜用药品。 Ⅲ 水性口服制剂（抗酸剂除外）
Ⅳ 水性抗酸剂
注：欧洲药典将ＩＩ１类和ＩＶ类合并为ＩＩｌ类。 ２试验用菌株的种类、保存及制备方法 用于防腐效力测试的菌株应涵盖微生物的各个 类别，如细菌、酵母菌和霉菌等，所选用的菌株应 是常见致病菌的代表。表２列举了美国药典和欧洲 药典推荐用于药品防腐剂抗菌防腐效力测试的菌株 及其主要制备条件。 表２ 抗茵防腐效力测试用菌株及其制备条件 －
注：１．欧洲药典未将大肠埃希氏杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ）列为防腐剂效力测定的常规试验用菌种，但建议对口服产品的防腐效力检测增加该 菌种；并建议增加Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ（ＩＰ ２０２１．９２）对含糖量高的口服产品的检测。 ２．ＴＳＡ／ＴＳＢ分别指大豆胰蛋白胨琼脂（Ｓｏｙｂｅａｎ－－Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ａｇａｒ）和大豆胰蛋白胨肉汤（Ｓｏｙｂｅａｎ－－Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ）。基准配方， 升培养基内含消化性胰酪蛋白１７．０克、消化性大豆酪蛋白３．０克、氯化钠５．０克、磷酸氢二钾２．５克、葡萄糖（Ｃ６Ｈ１２０６．Ｈ２Ｏ）２．５克、 纯水加至１０００毫升，用１Ｎ的氢氧化钠调节ｐＨ值，使灭菌后培养基ｐＨ＝７．３士０．２。向ＴＳＢ配方中再加入１５．０克琼脂后，即成ＴＳＡ。 ３．ＳＤＡ／ＳＤＢ分别指萨布罗氏葡萄糖琼脂（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）和萨布罗氏葡萄糖肉汤（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ）。基准配方，一 升培养基内含葡萄糖４０．０克、动物组织消化水解液和胰蛋白胨等比混合物１０．０克、加纯化水至１０００毫升，用１Ｎ的盐酸调节ｐＨ值，使 灭菌后培养基ｐＨ＝５．６士０．２。向ＳＤＢ配方中再加入１５．０克琼脂后，即成ＳＤＡ。
菌株的生理条件是影响试验结果的关键因素。 所有试验用菌株自菌种中心购买后的转种次数不得 超过五代；菌种应于低温冷冻（宜在一３０℃以下的 冰箱或液氮内）保存。如果该菌种是用液体培养基 培养的，保存前应将菌种的新鲜培养物（１８～２４ 小时培养物）进行离心（离心速度通常约为４０００ 转／分钟），然后用约二十分之一体积的无菌肉汤 （ＴＳＢ）将沉降的细胞悬浮于其中，最后向其中加 入等体积的无菌甘油（浓度为２Ｏ％），混匀后即予 冷冻保藏。如果该菌株是用固体培养基培养，则将
维普资讯 http://www.cqvip.com 中国药事２００５年第１９卷第１ｏ匍 · ５９３ · 生长在琼脂表面的菌落（或菌苔）刮下来并收集于 含１Ｏ 甘油的无菌肉汤培养基（ＴＳＢ）内，然后 分装至若干支无菌小试管（１．５～２．０毫升，带螺 旋盖帽）内，于低温下冷冻保存备用。使用时，取 出一支小试管，并接种于相应的固体或液体培养基 内培养并制备实验菌悬液。 表２列出了制备实验菌悬液时各菌种的要求。 如该菌种系采用固体培养法培养，制备菌液时应用 少量无菌生理盐水（３～５毫升）将琼脂培养基表面 的细菌细胞和白色念珠球菌细胞洗下来并收集于适 当的容器中，再用无菌生理盐水将收集到的微生物 细胞稀释至适当浓度（通常为１ｘ１０ ＣＦＵ·ｍｌ ）； 但黑曲霉菌则需延长培养时间直至产生孢子，用少 量含０．０５％聚山梨酯（吐温）８０的生理盐水溶液（３ ５毫升）将孢子淋洗下来并收集于一无菌容器内， 再用无菌生理盐水将收集的孢子液稀释至适当浓度 （通常为１ｘ１０。ＣＦＵ·ｍｌ ）。用液体培养基培养 的菌种于培养结束后（黑曲霉菌只能采用固体培养 基培养），先用离心法将细胞沉降后，再用适量的 无菌生理盐水溶液将细胞稀释至１ ｘ １０ ＣＦＵ· ｍｌ一。细菌、酵母细胞和霉菌孢子的浓度通常都 可采用比浊法来进行估测，但同时还采用平皿菌落 计数法进行对照检查以确认比浊法的可靠性。制备 好的细菌和酵母细胞悬液宜在低温（２－－８℃）下保 存并于２４小时内使用，但霉菌孢子悬液可于一周 内使用。超过保存时间，则需重新制备ｏｔ４３ ３ 测定方法 测定时，可直接将制备好的新鲜（２４小时之 内）实验菌悬液无菌操作加入样品，如：采用无菌 注射器刺入弹性胶塞内；如果直接接种不方便或是 原容器内的样品量不足，也可无菌操作将足够量的 样品加入一适当的无菌带帽小试管内，然后再向小 试管中接入菌种。每个样品容器内只接一种试验菌 悬液，并且菌悬液的加入量不得超过样品体积的 １．０ ，即如果容器内的样品量为１００毫升，则加 入的菌悬液体积不得超过１．０毫升。菌悬液与样品 溶液经充分混匀后，实验菌株的细胞或孢子浓度应 控制在１ ｘ １０ ＣＦＵ·ｍｌ 至１ ｘ １０ ＣＦＵ·ｍｌ 之 间。实验菌悬液与样品溶液一经混匀后，将其置于 ２ｏ～２５℃下培养，在起始和指定的时间间隔内分 别对每个容器取样（每次取１．０毫升或１克）并参 照表２中的培养条件对菌液浓度进行计数检查，也 可参照药典的微生物限度检查法进行计数检查。计 数时，既可采用平皿菌落计数法，也可采用薄膜过 滤法。微生物细胞或孢子的浓度单位均以ＣＦＵ· ｍｌ 表示，然后将每个浓度数据换算为标准对数 值，最后计算各时间间隔下的对数下降值。 在微生物计数过程中，采取适当措施消除或中 和样品中防腐剂的抑菌性是计数成功和准确的关 键。防腐剂的中和方法通常有以下三种：加入化学 中和剂、稀释样品和薄膜过滤。根据样品特性，可 将这三种方法组合使用。表３列举了部分药品用防 腐剂及其对应的有效中和剂（亦称为钝化剂）。中 和剂使用要得当，过量使用也会产生抑菌作用；稀 释时所用的稀释倍数应保证菌落计数结果的有效性 和可靠性（如每个平皿中的有效菌落数应在３ｏ～ ３００个之间，直径为４７毫米的薄膜上的有效菌落 数宜在１００个以下）。因此，效力测试实验前应先 对防腐剂的中和方法进行验证，以保证检测结果有 效、可靠。
表３药品用防腐剂及其对应的中和剂（钝化剂） ｓ］ 防腐剂的类别 中和剂 戊二醛、汞制剂 酚类、酒精、乙醛、山梨酸酯 乙醛 季铵盐类化合物、对羟基苯甲酸酯类、 双缩胍类 ＥＤＴＡ 季铵盐类化合物、碘、对羟基苯甲酸酯 类 汞制剂 汞制剂、卤化物、乙醛 硫酸氢盐 常规稀释液 甘氨酸 卵磷脂
Ｍｇ 或Ｃａ 离子 聚山梨酯
硫基醋酸盐 硫代硫酸盐
４ 防腐效力测定方法的验证【４ ］ 防腐效力测定方法的验证试验是为了证明样品 预处理方法能将样品的抑菌性有效中和或消除，同 时也证明所采取预处理方式及整个检测过程及检测 条件等均不会影响样品中残存的试验菌的生长。 验证时，试验菌株的制备方法须与上述防腐剂 防腐效力测定用试验菌株的制备方法和接种量均相 同；同时，对每个试验用菌株准备以下三组样品： 样品组、蛋白胨对照组和和阳性对照组。 样品组：按既定方法中和或稀释或过滤样品 （或采用组合方法），再向其中接入试验用菌株，接种 后菌液浓度与上述防腐试验相同，按照常规检测程 序和培养条件检查试验用微生物的恢复生长情况； 蛋白胨对照组：除了用Ａ溶液（０．１ 蛋白胨 溶液）替代实际样品外，中和方式、检测程序和培 养条件等均与样品组相同； 阳性对照组：不经中和处理，将试验菌株稀释
维普资讯 http://www.cqvip.com ５９４· 中国药事２００５年第１９卷第１Ｏ期 并直接接种于固体琼脂培养基培养（稀释倍数与前 两组试验相同）。 如果样品组与蛋白胨对照组的微生物生长数量 相似（无论采用平皿菌落计数法还是采用薄膜过滤 法，二者检测结果之间不超过３Ｏ ），则表明中和剂 具有足够的中和效力，即该中和方式有效消除了样 品的抑菌性；如果蛋白胨对照组与阳性对照组的微 生物生长数量相似（二者检测结果之间不超过 ３Ｏ ），则表明样品预处理用中和剂的毒性、检测程 序和培养条件等均未对试验用微生物的生长有不良 影响。需对试验用每个菌株均进行上述验证试验。 为考察检验方法的稳定性和重现性，验证时， 至少需考查三个不同批号的同类产品，分别进行三 次验证试验。 ５ 合格标准［４ 美国药典和欧洲药典对防腐剂的防腐效力标准 有一些差异。但总的说来，欧洲药典对防腐剂的防 腐效力标准比美国药典的相关要求更加严格。为了 充分理解和把握美国药典和欧洲药典对防腐效力标 准制定的特点及标准间的差异性，特将这两国药典 的防腐效力标准列于表４和表５。 表４美国药典对防腐剂防腐效力的合格标准 ‘
注：“无增加 是指微生物浓度对数值与前次检测结果的对数值之差 不得超过０．５个对数单位
表５欧洲药典对防腐剂防腐效力的建议性合格标准 ］ 微生物 — 号
注：１．ＩＩＩ类药品包含表１中的ＩＩＩ类和ＩＶ类药品； ２．Ａ标准为推荐性指标。但是，在某些因素条件下，例如会增 加毒副反应的风险等，则可采用Ｂ标准
最后，要强调指出的是，防腐剂的使用不能替 代ＧＭＰ的执行，在生产过程中，严格执行ＧＭＰ 依然是制药企业的首要任务。
参考文献： ［１３ Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ＣＰＭＰ／ＱＷＰ／１１５／９５．Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｓ］．１９９７：１ １－２３ Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ＣＰＭＰ／ＱＷＰ／４１９／０３．Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ， ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｏｓｓｉｅｒ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｒｋｅｔｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｃｕｃｔ Ｉｓ］．１９９８：１ ［３］Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ＣＰＭＰ／ＱＷＰ／１５５．／９６．Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ＩＳ］，１ ９９８：１ ［４］ ＵＳＰ［Ｓ］．ｅｄ ２６（ＩＩ） ２００３：２００２ ［５］ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ—ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２０００．Ｉｓ］．２００２： ４０７ ［６］ ＵＳＰ ＩＳ］．ｅｄ ２６（ＩＩ）２００３：２４４２