衬里为材料，容积一般为0.5～2L为宜。放置位置：高于泵体，保持一定的输 液静压差。
注意：密封、过滤
对流动相溶剂的一般要求
➢ 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 ➢ 适用于所选择的检测器。 ➢ 化学惰性好，以免破坏固定相。 ➢ 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 ➢ 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。 注意: 1.所有溶剂在放入贮液罐之前必须经过0.45μm滤膜过
（4）梯度洗脱装置
➢ 梯度洗脱：通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改 变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。
➢ 梯度洗脱的特点：改善分离, 加快分析速度；改善峰形, 减 少拖尾;可能引起基线漂移
➢ 类型：高压梯度与低压梯度
2.进样系统
➢ 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，要求密封性 好，死体积小，重复性好，进样引起色谱分离系统的压力 和流量波动要很小。
（2） HPLC检测器的要求
➢ 具有高灵敏度和可预测的响应； ➢ 对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异 性，适用范围广； ➢ 温度和流动相流速的变化对响应没有影响； ➢ 响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱； ➢ 死体积小，不造成柱外谱带扩展； ➢ 使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修； ➢ 响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽； ➢ 不破坏样品组分； ➢ 能对被检测的峰提供定性和定量信息； ➢ 响应时间足够快。
常用的进样器有以下二种：六通阀进样器和自动进样器
3.分离系统
分离系统的主要部件是色谱柱。 一般要求：柱效高、选择性好、分析速度快是
对色谱柱的。色谱柱管为内部抛光的不锈钢 柱管或塑料柱管，
色谱柱的种类
➢ HPLC微粒填料：硅胶，以及以硅胶为基质的键合相、氧 化铝、有机聚合物微球
➢ 填料粒度：3μm、5μm、7μm、10μm等 ➢ 柱效的理论值：5000~16000块理论塔板数 ➢ 柱长：100~300mm ➢ 柱内径：4.6 mm或3.9 mm常用
滤，除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进样阀产生 阻塞现象。
2. 所有溶剂在使用前必须脱气
（2）高压输液泵
• 高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件，其作用是将流 动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。对于带有 在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置后再输送 到色谱柱。
要求：由于高压输液泵的性能直接影响到分离分析结果的好坏，因此，实际 分析过程中为了保证良好的分离分析结果，要求高压输液泵必须满足以下几 点要求：
二、高效液相色谱的主要类型
（一）液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1.分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心 能力的差异
2.固定相：与LC比，固定相粒径不同（＜10μm） 硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 5～ 6μm 5×104 球形 YQG 3～4μm 8×108
分离过程
高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压 力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导 入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各 组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号 送至工作站记录、处理和保存。
1.高压输液系统
➢ 贮液器 用途: 来提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析工作。 要求：1、必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液； 2、脱气方便； 3、能耐一定的压力；第四、所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。 4. 贮液器一般是以不锈钢、玻璃、聚四氟乙稀或特种塑料聚醚醚酮
保护柱：
一般在色谱柱前要求安装保护柱，即在 分析柱的入口端、装有与分析柱相同固定相 的短柱（5～30mm长），可以经常而且方便 地更换，因此，起到保护延长分析柱寿命的 作用
色谱柱恒温系统：
➢ 由于分析的需要，色谱柱有时需要有一定的温度，提高柱 温有利于降低溶剂粘度和提高样品溶解度，改变分离度， 也是保留值重复稳定的必要条件，特别是对需要高精度测 定保留体积的样品分析而言尤为重要。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分 4. 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱， 适于分离非极性组分
（三）.键合相色谱法
➢ 常规化学键合相： 利用化学反应将固定液的官能团键合 在载体表面 ① 分离原理：分配 + 吸附（以LLC为基础） ②．特 点：不易流失，热稳定性好，化学性能好，载样量大，适 于梯度洗脱
底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF ④ 流动相极性与k的关系：
流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ ⑤ 出柱顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱
➢ 正相键合相色谱 ① 分离原理：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键 作用力 ② 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 ③ 流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂
例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 ④ 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ ⑤ 出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后 出柱 ⑥ 适用：分析极性大物质、糖类等
（四）. 凝胶色谱法(SEC)
① 分离原理：凝胶色谱又称为体积排阻色谱(SEC)，是按溶 质分子大小进行分离的一种色谱法。
➢ 配制酒类：称取10.0g试样，放入小烧杯，水浴加热除去乙醇，用氨水 （1+1）调pH约7.加水定容至适当体积，经滤膜过滤（0.45μm）。
5. 结果的表示和计算：
试样中苯甲酸含量（g/Kg）,按下式计算
X A1000 mV 21000 V1
式中 X ------试样中苯甲酸的含量（g/Kg） A-------进样体积中苯甲酸的质量（g） V2 -------进样体积，（ml） V1 -------试样稀释总体积，（ml） m-------试样质量，（g）
1、泵体材料能耐化学腐蚀； 2、能在高压（30～60MPa）下连续工作； 3、输出流量稳定（±1%），无脉冲，重复性高（±0.5%），而且输出流量范
围宽； 4、适用于梯度洗脱。
类型：恒压泵和恒流泵两大类
（3）过滤器
在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间，应设 置过滤器。过滤器的滤芯是用不锈钢烧结构材料制造的， 孔径为2～3µm，耐有机溶剂的侵蚀。若发现过滤器堵塞 （发生流量减小的现象），可将其浸入稀HNO3溶液中， 在超声波清洗器中用超声波振荡10～15min，即可将堵塞 的固体杂质洗出。若清洗后仍不能达到要求，则应更换滤 芯。
➢ 高效液相色谱仪中常用的色谱柱恒温装置有水浴式、电加 热式和恒温箱式三种。实际恒温过程中要求最高温度不超 过60℃，否则流动相气化会使分析工作无法进行。
4. 检测系统
作用：连续监测被色谱系统分离后的柱流出物组 成和含量变化的装置。其作用是将柱流出物中样 品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，完 成定性定量分析的任务。
➢ 反相键合相固定相 ① 分离原理：疏溶剂理论
正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑ ， k↑，组 分tR↑
反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓， k↓，组 分tR↓
② 固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）
③ 流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性
➢ 苯甲酸标准使用溶液：取储备液10.0ml,放入100ml容量瓶 加水稀释至刻度，摇匀。经0.45微米滤膜过滤。
3.仪器及条件
➢ 高效液相色谱仪；紫外检测器(FID)； ➢ 色谱柱;YWG-C18 4.6㎜×250mm； 10μm不锈钢柱 ➢ 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02mol/L）(5:95) ➢ 流速：1ml/min ➢ 进样量：10μL ➢ 检测器：紫外检测器，230nm,0.2AUFS 注：根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如 ECD 和较灵敏的通用检测器 （FID 和 TCD） 流动相为气体，无毒，易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
几乎可以分析各种物质 可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器① 流动相有毒，费用较高 运行和操作比 GC 难一些 仪器制造难度大
5. 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
（二）.液液分配色谱法（LLC）
1.分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 2.固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）
缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性→NLLC 固定液——非极性→RLLC 3.正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC）
➢ 液相色谱法的基本原理 ➢ 液相色谱仪基本构造及使用方法； ➢ 液相色谱法的定性分析及定量分析方法
学习情境
： 1.试验原理 将试样加温除去二氧化碳和乙醇，调pH
至近中性，过滤后进入高效液相色谱仪，经反相色谱分离 后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
2. 试剂
➢ 甲醇：经滤膜过滤（0.5微米） ➢ 稀氨水（1+1）：两者等体积混合 ➢ 乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g的乙酸铵，加水至1000ml.溶
解，经0.45微米滤膜过滤。 ➢ 碳酸氢钠溶液（20g/L）:称取 2g碳酸氢钠（优级纯），加水至100ml
摇匀 ➢ 注：方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为蒸馏水，
溶液为水溶液。
➢ 苯甲酸标准储备液：准确称取0.1000g苯甲酸，钾碳酸氢 钠溶液（20g/L）5ml,加热溶解，移入100ml容量瓶中，加 水定容，苯甲酸含量为1mg/mL
堆积硅珠 YQG 3～4 μm 8×108 理想 原理：吸附 特点：峰易拖尾 高分子多孔小球：YSG 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低