美国医学家W 美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱 氨酶缺乏症（ADA ADA缺乏症）的基因治疗，是 氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是 世界上第一个基因治疗成功的范例
1990年 1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁 14日 安德森对一例患ADA缺乏症的 缺乏症的4 女孩谢德尔进行基因治疗。这个4 女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因 有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全， 有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全， 只能生活在无菌的隔离帐里。 只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中， 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这 种白血球都已经过改造， 种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的 基因所替代。在以后的10个月内她又接受了 个月内她又接受了7 基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后， 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 谢德尔， 谢德尔，1999
双抗体夹心法
检测大分子抗原
间接法 检测抗体
竞争法 测定小分子抗原或半抗原， 测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体
双夹心法 测定大分子抗原
特 异 性 相 同 ， 来 源 不 同
3、使用多克隆抗体的缺点 、
①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备 同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异， 的抗体的量之间也会有差异 ②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之 无法区别相类似的目标分子： 间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分， 间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分， 因为在ELISA检测中都会发生颜色变化 检测中都会发生颜色变化 因为在
单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置
4、酶联免疫吸附测定的局限性 、
仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作 ELISA结果容易造成误诊 为一种初步的检测手段， 为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进 行western检测 western检测 要提高ELISA检测的准确度, 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特 ELISA检测的准确度 异性 在使用抗体时， 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位 点的基因要表达 而且目标位点不能够以任何方 基因要表达， 点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方 式被覆盖或阻断， 式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结 合
基因诊断的特点 特异性高 检测目标是基因， 检测目标是基因，为原始的致病因素 灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需pg水平 待测标本往往微量，目的基因只需 水平 稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定， 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需 处于活性状态 诊断范围广， 诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态 确切的诊断， 临床应用前景好
DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, RFLP， micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP RNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays RTProtein ImmunoWestern blot, Immuno-histochemistry, microarray
现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分 子生物学的方法对病原物质进行诊断检测
一种有效的诊断方法应具备： 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分 专一性（specificity） 子产生阳性反应 2、灵敏度(sensitivity)高 灵敏度(sensitivity)高 (sensitivity) 3、操作简单(simplicity) 操作简单(simplicity)
Southern blot
N
T
T
N
T
T
N
FISH
PCR 技术
DNA 测 序
DNA芯片技术的概念 DNA芯片技术的概念
指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将 指在固相支持物上 原位合成寡核苷酸或者直接将 原位合成寡核苷酸 于支持物表面， 大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面 大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面， 然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得 然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析， 出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）
基因治疗的机理
基因置换： 基因置换：正常基因取代致病基因 基因修正： 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 基因修饰： 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达 基因抑制：外源基因干扰、 基因封闭： 基因封闭：封闭特定基因的表达 “自杀基因”的应用 自杀基因” 免疫基因的治疗 耐药基因的治疗
第二节 DNA诊断系统 诊断系统
DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学 诊断的理论基础： 诊断的理论基础 特性的DNA序列都应该是独特的， 特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作 DNA序列都应该是独特的 为专一性的诊断标记
一、核酸杂交
1、工作原理： 、工作原理： 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成 ◆ 两条 链之间可以通过碱基配对而形成 氢键 2、3个关键要素： 个关键要素： 、 个关键要素 探针DNA ★ 探针 目的DNA ★目的 ★ 信号检测
由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术 由于在制备过程中运用了 计算机芯片的制备技术 计算机芯片 如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片 硅芯片作为固相 如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相 支持物，所以称为DNA DNA芯片技术 支持物，所以称为DNA芯片技术
DNA芯片技术原理 DNA芯片技术原理 大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA 双链碱基互补配对、变性和复性的原理
以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针 或基因片段作探针， cDNA 或基因片段作探针 ， 检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息
DNA芯片技术流程
Biological Sample
酶联免疫吸附测定(enzyme酶联免疫吸附测定(enzyme-linked (enzyme immunosorbant assay,ELISA)
一、酶联免疫吸附测定的原理
工作原理： 工作原理：
主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合 假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于 假定目标分子是一种蛋白质， 检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质， 检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 ）， 免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体
arrayer
microarray
Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis
“Hybridize”
Scanner
Analyze data
基因诊断的原理
利用分子生物学和分子遗传学的技术， DNA或 利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA 水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态， 水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从 而对疾病做出诊断的方法 策略 检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的的致病基因 检测表型克隆基因
体外培养、 体外培养、接种
能检测到活的寄生虫， 能检测到活的寄生虫，并 可检测感染性和感染程度
抗体检测
简单、快速、 简单、快速、能够实现自 动化， 动化，可用于检测大量的 样品 快速灵敏， 快速灵敏，能够实现自动 化，可以分辨不同种的寄 生虫， 生虫，不需要以前有寄生 虫感染病史
Байду номын сангаас
DNA杂交及PCR DNA杂交及PCR 杂交及
主要依据： 碱基互补、 主要依据： 碱基互补、变性和复性 碱基互补 变性： 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 复性： 随温度逐渐恢复， 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补 双链 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; 与 杂交： 杂交 、 DNA与RNA杂交 A=U、 G≡C ; 与 杂交: 杂交 、
分子诊断
利 用 PCR 技 术 或 PCR 与 分 子 杂 交 标记相结合， 标记相结合 ， 可 以快速准确地检 测出病原性物质。 测出病原性物质 。
分子诊断
遗传性疾病的诊断
羊水和胎盘绒毛膜检测
第一节酶联免疫吸附测定
抗体高度特异地与抗原分子结合 通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测 通过抗原 抗体的特异识别反应进行检测
核酸分子杂交（固相杂交） 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 分离、变性、转移、固化 片段 预杂交 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
第七章 现代分子诊断技术
酶联免疫吸附测定 DNA诊断系统 DNA诊断系统 DNA指纹 DNA指纹 遗传性疾病的分子诊断技术
基因诊断
基因 蛋白质 性状
基因 诊断
生化 诊断
临床 诊断
传统的诊断程序
先要对病原物质进行培养， 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的 生理学特性 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌， 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌， 还是其他物质 实践证明:比较有效, 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比 较特异 诊断成本高、速度慢、 诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、 如砂眼衣原体、朊病毒