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核酸分子杂交示意图 核酸分子核酸分子杂交技术
斑点杂交（spot blot hybridization）
凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization)
原位杂交（in-situ hybridization）
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基因芯片技术原理
大规模集成的固相杂交
基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA 双链碱基互补配对、变性和复性的原理
以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息
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基因芯片的作用原理
在适当温度、盐浓度下，双链能按硷基互 补配对原则(A-T,C-G)复性而重新成为双链 核酸。
用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸 探针，与变性后的待测标本核酸进行杂交， 通过检测标记探针的信号，可判断标本是 否存在与探针互补杂交的同源核酸。
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核酸分子杂交探针的制备
制备探针的靶核酸可通过: 分离、切割病毒的特定核酸片段获得; 用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，
经扩增和纯化大量获得; 选择已知病毒的一段基因序列，用人工方
法合成寡核苷酸，其长度以20个左右最为 常用，过短易出现非特异性杂交。
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核酸分子杂交探针的制备
常见的用于标记探针的示踪物质
放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，杂交 后可通过放射自显影技术进行检测
非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等， 杂交后可通过底物显色、化学发光等技术 进行检测
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Think You
基因芯片
基因芯片（或DNA Chip,或
Microarray）又称DNA微阵 列，是指固定在固相载体上的 高密度DNA微点阵。即将大量 靶基因或寡核苷酸片段有序地， 高密度地（点与点间距一般小 于500μm）排列在玻璃、硅 等载体上，称之为基因芯片。
DNA Microarray
上图显示大量的DNA探针，按照一 定的规律有序地排列在支撑物上， 每个探针与相对应的特异互补序 列结合后，即可发出荧光。利用 该芯片可同时获取大量信息。
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斑点杂交
Dot Bolt Hybridization for HBV DNA Quantitationin 5 μl of Patient Sera
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凝胶电泳印迹转移杂交
原位杂交
(Southernblot hybridization) (in-situhybridization ）
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基因芯片的 制作方式
原位合成
原位光蚀刻合成 光导原位合成法 原位喷印合成
直接点样
针式点样 喷墨点样 分子印章法
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基因芯片技术流程
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基因芯片的应用
基因表达分析
分析基因表达时空特征 基因差异表达检测 发现新基因 大规模DNA测序
基因型、基因突变和多态性分析
引物延伸时，由于聚合 酶具有的5’→3’‘核酸外切 酶作用，可把荧光报告基 团从探针上切下，因与淬 灭基团远离，发出的荧光 不被淬灭，随模板扩增和 游离荧光报告基团的增加 而增强，并和初始靶核酸 的量呈正相关。
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TaqMan法应用
起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 单核苷酸多态性（SNP）分析
������ 非对称PCR ������ 免疫PCR ������ 定量PCR ������ 随机引物PCR ������ 简并引物PCR ������ 锚定PCR
������ …
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实时荧光定量PCR荧光检测技术
SYBR Green I。是一种结合于所有dsDNA双 螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
分子诊断技术
常见的核酸分子诊断技术
核酸分子杂交
( Nucleic acid molecular Hybridization)
基因芯片（ Gene Chip ）
聚合酶链反应( polymerase chain reaction reaction；PCR)
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核酸分子杂交的原理
双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链 成两条互补的单链核酸。
PCR不仅可检测各种DNA病毒的核酸，还可经过 逆转录，检测各种RNA病毒的核酸，因而在各 型肝炎病毒的检测中，敏感性远超过分子杂交， 有着不可替代的作用。
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PCR 的常见类型
常规PCR 逆转录PCR（RT－PCR） 巢式PCR〔nested-PCR〕 原位PCR（in-situ PCR） 多重PCR
疾病的诊断与治疗
遗传病相关基因的定位 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断 耐药菌株和药敏检测
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聚合酶链反应
(polymerase chain reaction
reaction；PCR)
PCR是八十年代中期问世的一种体外模拟体内 DNA复制过程的技术，可在短时间内将待测特 异性DNA扩增百万倍以上，并具有简单、快速、 特异的特点，成为分子生物学发展史的又一个 里程碑。
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核酸分子杂交技术的应用
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的 特异性，因而该技术在分子生物学领域中 已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图 谱的制作、基因组中特定基因序列的定性 等
在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的 基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病 病原体的检测等领域中 。
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TaqMan 水解探针。由产荧光基团，荧光淬 灭基团，与扩增子有互补的特异核苷酸序 列组成。
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实时荧光定量PCR：水解探针法
退火 延伸 切割 聚合完成
该法也称TaqMan技术， 在PCR系统中，加入能和 靶核酸模板杂交的探针， 其5’端带有荧光报告基团， 发射的荧光被3’端带有的 荧光淬灭基团所吸收。