(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确 保产生相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的 限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ 会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个， 则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复
(3)某DNA分子片段含有1 000个碱基对(即bp)。经扩增 后，通过只用限制酶EcoRⅠ与同时用EcoRⅠ和HalⅢ两 种方法切割，其电泳结果如图丙所示，可推断限制酶 HalⅢ在该DNA片段上的切割点有________个。
【解析】(1)根据题干信息“野生型腺病毒含有抑制 P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1”， 构建基因表达载体时，应选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割载 体和含有目的基因的DNA，这样既可以去除E1基因以防 止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏55Kda基因 以防止其抑制P53基因的活性。(2)由于切下的片段有 可能与原基因重新结合，因此将目的基因与腺病毒重
(6)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性 末端。 ( × ) 分析：E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端。
高考角度全练 角度1 限制酶、DNA连接酶的作用 1.(2017·西安模拟)正常细胞中含有抑癌的P53基因， 若它失活而不能表达，则基因突变的细胞易形成肿瘤。 基因治疗肿瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖细 胞和对人体基本无害而成为良好的基因载体。野生型 腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及

答案：(1)EcoRⅠ和BamHⅠ E1 55Kda 抑制 P53基因的活性 (2)切下片段有可能与原基因重新结合 (3)2
【方法技巧】限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的 种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图
甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如 图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也 可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也 可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上 也有这两种酶的切割位点)。
黏性末端
平末端
2.DNA连接酶： (1)功能：缝合被限制酶切开的两个核苷酸之间的_磷__ _酸__二__酯__键__。 (2)不同连接酶的比较(连线)：
3.载体： (1)常用载体：_质__粒__，其化学本质是独立于拟核之外 的_双__链__环__状__DNA分子。 (2)其他载体：λ噬菌体的衍生物、_动__植__物__病__毒__等。
组时，重组的成功率较低，依然还有大量非重组的野 生型病毒的DNA。(3)只用限制酶EcoRⅠ切割能产生700 bp、200 bp和100 bp三种长度的DNA片段，同时用 EcoRⅠ和HalⅢ两种酶切割可产生420 bp、280 bp和 100 bp三种长度的DNA片段，可见，限制酶HalⅢ又将 长度为700 bp的DNA片段切成420 bp和280 bp两段，将 长度为200 bp的DNA片段切成100 bp的两段，由此可推 断，限制酶HalⅢ在该DNA片段上的切割位点有2个。
【思维诊断】 (1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6 个核苷酸序列。(江苏高考) ( × ) 分析：大多数限制性核酸内切酶的识别序列由6个核苷 酸组成，少数限制性核酸内切酶的识别序列由4、5或8 个核苷酸组成。
(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基 因。(江苏高考) ( × ) 分析：载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标 记基因。
考点一 基因工程的工具 核心知识回顾
1.限制性核酸内切酶(简称：_限__制__酶__)： (1)来源：主要从_原__核__生物中分离纯化而来。 (2)作用：识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序 列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 _磷__酸__二__酯__键__断开。
(3)结果：产生_黏__性__末__端__或平末端。 已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点 分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在下图中写出这两种限制 酶切割DNA后产生的末端种类。
(3)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之 稳定存在并表达。 ( √ ) 分析：载体必须能在宿主细胞内稳定保存并大量复制， 使目的基因稳定存在并表达。
(4)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。( × ) 分析：DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，两碱基 间氢键的形成不需要酶的催化。 (5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程 中常用的三种工具酶。 ( × ) 分析：质粒的化学成分为小型环状DNA，作用为运输目 的基因的载体，不是起催化作用的酶。
病毒复制基因E1，因此需要重新构建有疗效的、安全 的腺病毒。图甲、乙中箭头所指为相应限制酶切点。
世纪金榜导学号
(1)构建重组腺病毒时，限制酶最好选择____________ _____，这样既可以去除________基因以防止病毒复制 后损伤健康细胞，同时还能破坏____________基因以 防止其___________________________。 (2)将目的基因与腺病毒重组时，重组的成功率较低， 依然还有大量非重组的野生型病毒的DNA，这是因为__ ___________________________。
(3)特点及意义：
特点
意义
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可 扩大
有_一__个__至__多__个__限制 酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的_标__记__基因 便于重组DNA的鉴定和选择
【教材易漏边角知识】选修3 P6“寻根问底” DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。 _不__相__同__。__D_N_A_连__接__酶__连__接__的__是__两__个__D_N_A_片__段__，__而__D_N_A_聚__ _合__酶__连__接__的__是__单__个__的__脱__氧__核__苷__酸__。