找出相应的 Ｄ Ａ含量。从产物含量的增加 Ｎ
量或底物含量的减少量来求得酶活力。
结 果 与 讨 论
（ 一）底物 ＤＮ 的标准 曲线 Ａ 以 几
Ｄ ＮＡ制作标准曲线， 反应液中不加酶液 。标 准曲线的含量范围为０ ７－１０ ｌ， ． ５ ． ０ 在此范 ０ ０ ｕ ｇ
围内， Ｎ 含最与 Ａ Ｄ Ａ Ｓ有很好的线性关系。 结
Ａ Ｓ为负片上样品黑度与背景黑度之 差，Ｃ为 样品的含量， 单位为 ｊ ， ｕ ｒ ｇ 为反衬度， 是与感光 板性质有关的常数， 为自吸收系数， ｂ 。为与样 品激发有关的参数， 在一定实验条件下， 与 ａ ｂ 均为常数。由此可见， 根据以上公式， 则可定量 侧定酶反应后产物 Ｄ ＮＡ 带含量的增加量， 或 底物 Ｄ ＮＡ 带含量的减少量， 从而能定量测定 限制性内切酶的活力。
影响
以０ ５ｇ Ｎ ． １ ２ Ａ为样品，电泳后胶 ２ｃ Ｄ
我们又以 Ｉ Ａ为底物， Ｄ Ｎ 测定了 Ｐｌ ｓ １酶 的 Ｋ 值。反应速度用底物的减少量表示。 ｍ 通 过测定底物剩余带的黑度，在标准曲线上查出
板分别放置 １ 小时， －６ 并且依次拍照，结果如 图３ 所示。从图 ３ 中可见，荧光强度随放置时 间的增加而减弱。结果表明，在电泳以后 ４ 小
２
ｌ Ｊ Ｊ
３
４
５
七丁ｘ （） － １ Ｍ－ ０ ｌ ８
０ ０２ ． ０４ ． ０６ ． ０８ ． １０ ．
酶 单位
图 ４ 限制性核酸内切酶 Ｂｐ Ｋ 值的 ｓ ６１ｍ ３ 改良 倒数图 双
图 ２ 限制性核酸内切酶 Ｅ ｏ ｃＲ Ｉ的酶浓度实验
（ 三）电泳后凝胶放置时间对荧光强度 的
ｔ ｎ ｉ Ｅｎｄ ｎ ｌ ｓｓ ｏ ｏ ｕｃｅ２ｅ
需要昂贵的仪器，故它们的使用范围受到一定
３４
１ ）本工作曾得到本校化 学系分析化学教研室张 悟 铭、半 振环同志的 帮助 ， 在此谨致谢忱。 本文于 工８ 年 ６月 ２ ９６ １日收到。
置测微光度计上进行测定，以此来对酶活力进
行定量。
ＩＮ ． Ｄ Ａ谱带移近狭缝， 利用微动螺旋使谱带慢
时内拍照，结果均较为满意。这使我们既能保
３ ６
［ ］ Ｍｘ ｉ ， 。 ａ ： ６ Ｊ Ｂｏ Ｃ ｅ ． ２１ ， ｉｒｈ Ｐ， 。 ｌ １７． ｉ ． ｍ， ， ｌｃ ． ． ９ ． ｉ ｈ ５
５６ ８ ６－
的标本能获得较多的中期分裂相，染色体分散 好， 形态佳， 更重要的是该方法制作的标本经一 系列处理后， 可进行染色体显带， 故而空气干燥 法被现代细胞遗传学研究广泛采用。节肢动物 由于细胞来源不丰富， 细胞培养又很困难， 所以 在染色体研究方法上受到了很大的限制。 Ｃｏ ｒ－
ｚｒ１６） ｉ（９８最早发明了一种适于昆 ｅ 虫染色体制
图 １ Ｄ Ａ 的 Ｉ Ｎ 标准曲线
曝光的乳胶部分，校正零点。随后测出琼脂搪
凝胶的黑度值 （０ Ｓ ）作为背景扣 除。 最 后将
此方法在 Ｄ ＮＡ 含量超过一定范 围会偏 离线性关系。另外，底片的曝光和显影等实验 条件要严格控制， 以避免误差。 （ 二）限制性核酸内切酶活力定ｔ测定 的
３５
结果 以不同量的酶作用于一定量的底物， 证良好的结果，又有充分的准备拍照的时间。 严格控制反应条件，酶切后谱带呈现的荧光强 （ 四）酶动力学常数 Ｋｍ 值 测定的结果 度不同，反映在照相负片上的黑度也不同。我 我们以 ｐ Ｒ ２ Ｄ Ｂ ３２ ＮＡ为底物， 测定３ Ｂｐ ＇ ｓ 们以限制性核酸内切酶 Ｅｏ ｃＲ Ｉ为例，用不同 ６ １酶的 Ｋ 值。反应速度 （）用单位时间 ３ ｍ Ｖ 量的酶作用于一定量底物 ｐＲ２ Ｄ Ａ 测定 内产物的增量表示。通过测定产物带 的黑度， Ｂ ３２ ， Ｎ 产物带的黑度， 换算成相应的产物含量， 用酶活 在标准曲线上查出对应的产物含量，作改良双 力单位与产物含量作图 （ ２。结果表明，它 倒数图，结果如图 斗 图 ） 所示。求 得其 Ｋ 值为 ｍ
备的空气千燥法Ｕ 这种方法既保证了在制作 １ ０
过程中不致使细胞丢失，又保持了常规空气干 燥法的优点， 特别适于少量细胞的染色体制备， 尤其果蝇的染色体研究（ 本文首次将此方法 ３ １ 。 用于蟀瞒染色体的研究 ，取得了较好的效果。 参 考 文 献
染色体。我们曾采用压片法对恙蟠生活史各期
进行过观察 ，结果显示 ， 幼虫、 卵、 若蛹、 旱期若
１ 一 １ ３． ７１ ７
［ ，］ Ｓｉ ｉ Ａ ｅ Ａ ： ８． Ｍ ｄ Ｐ ｌ ２（ ）６６一 ｈｒ ， ｔ １ ４ Ｊ ｅ ． ． １５： １ ａ ． ． ９ ． ａ ，
６７ １．
［ ］ Ｖ ｎ ｒｕ ｅ Ｆ 。Ａ． ８． ｉ Ｔ ｃｎ ｌｇ ， ６ ａ Ｂｅｇｌ ．Ｍ ． １ ０ Ｓａｎ ｅｈ ｏｏ ｙ ， ９ ｔ
们之间有良好的线性关系。我们还以 Ｉ Ａ Ｄ Ｎ
为底物， 酶反应后测定剩余底物的黑度， 换算成 相应的剩余底物的含量，作 Ｅｏ ｃＲ Ｉ的酶浓度
实验， 亦得到良好的线性关系。
０６ ．
１３ Ｘ ０８ ．３ １－ Ｍ，
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０
１
慢经过狭缝， 此时黑度标尺亦有移动， 读取最大
此方法的简单原理是根据 Ｄ Ａ与澳化 Ｎ
乙锭 （＇ Ｅ ）结合形成荧光络合物， Ｂ 在一定条件 下， 其荧光强度与 Ｄ Ａ 的含量成正比。由于 Ｎ
数据即为此谱带的黑度值 （） Ｓｏ
ＡＳ 二 Ｓ一 Ｓ Ｏ
负片上 Ｄ Ａ谱带的黑度 （）是谱带荧光强 Ｎ Ｓ
度的函数， 因此， 通过侧量谱带的黑度，最终可
１０ ０ 即 ｓ ｃ ７ ０ ６ ０ 伪
段进行分离， 压为６ ／ 电 Ｖ ｃ， ｍ
（ 二）凝胶板拍照 电泳后的凝 胶板置
心
５ ０
４ ０ ３ ０ ２ ０
于２４ｍ的紫外灯下照射３ 分钟，以便充分 ５ｎ ０ 激发， 然后用１５ ３ 照相机拍照（ 加红色滤光片） ，
并需采用同一牌号的全色胶卷及严格控制曝光 时间， Ｄ １ 显影液显影 ３ 分钟， － 定影 用 －９ ． ， Ｆ５ 液定影 １ 分钟， ５ 温度为 ２９ｏ ０ ｃ
（ 四）酶活力的定ｔ侧定 在酶 活力的 定量测定中，每 次需同时 做一 条标准 曲线
（． ５ ． ０ｇ，或带一个标准管。 目 ０ ７－１ ０ｐ） ０ ０ 的是
使待测凝胶板与标准曲线凝胶板在同一张底片 上拍照，降低误差。然后测量胶片上产物带的 黑度或未切底物谱带的黑度，对照标准曲线查
确定一个谱带所相应的 Ｄ Ａ含量。 Ｎ 根据ｕ Ａ 一；城 Ｃ十， 。 ＇ Ｓ ｂ 蜿 ，在式中
进食的雄虫减数分裂达高峰。因此， 我们认为， 研究恙蟒有丝分裂染色体， 材料以化蛹 １ 天 －３ 的成蛹为佳， 容易获得形态较好、 数较多的有丝 分裂中期相。 而要观察减数分裂和精子形成，
则以老熟成蛹或早期雄虫为好。
〔） 周 ２ 洪福等： ８０遗传， （）４） １３ ９ ５５： ５
【 ］ 北京大学生物系遗传教研室：９４ 遗传学实验技太和 ３ １８ 方法， 高等教育出版社，１７ ２６ ９ 一 ０． ［ ］ Ｃｏｉ ， Ｈ ： ６ ． ａｎ ｅｈ ｏ ｇ ， （） ４ ｒｚ ｒ Ｒ ｅ ． ． １ ８ Ｓ ｉ Ｔ ｃｎ ｌ ｙ ４ ３： ９ ｔ ｏ ３
虫均未能观察到染色体和分裂相细胞，老熟若 虫休内性腺开始发育， 偶可见有丝分裂细胞， 但
数：极少。 － ． 进人成蛹期后 ， 恙瞒体内生殖细胞的
有丝分裂旺盛，此时制作标本较易获得满意的 结果。５ 天龄的成蛹已趋成熟， －６ 有丝分裂减
弱， 减数分裂日趋旺盛并开始形成配子， 羽化后
【 ］ 廖翻溶 等：９ １ 动物学研究，２２：３一１３ Ｌ １８． （ ）１７ ４．
相应 余底 量； 的剩 物含 进而推 底 减少 算出 物的
量。其双倒数图亦有良好的线性关系。 我们认为本方法是一个可靠、实用的限制 性核酸内切酶定量测活方法。采用这种方法可 对限制性核酸内切酶进行多种酶 学方面 的研 究。所用的测微光度计乃为一般光谱分析之常 规仪器，具有操作简便、负片测定不受时间限 制， 样品用量少 （０８） １－ 的特点。 ９ 参 考 文 献
果见图 １ ａ
材 料 和 方 法
快速测微光度计为蔡司Ｉ型 （ｅｓ 东 Ｉ Ｚｉ Ｉ ｓ Ｉ ， 德产） 又 ＮＡ， Ｒ 。 Ｄ Ｅ口 Ｉ酶为北京生物物理所 ｃ
生物化学工厂产品 ｓ ６１ Ｐｒ 。Ｂｐ 和 ｓ 酶为本 ３ Ｉ
实验室制备。其他试剂为分析纯。 （ 一）酶切 ＤＮ 片段的电泳分离 Ａ 酶 切反应系统见文献〔） ２０采用 １ ％琼脂糖凝胶 ． ２ （ ０ Ｋ Ｅ ／ｌ 含 ． ｇ ｍ）平板电泳， ５ Ｂ 将酶切 Ｄ ＮＡ片
３７． １６
“ 一 １一 Ｚ ３ ４ ５ 啥 一 ， －
Ｉ（ 间 ） 时
图 ３ 电泳后凝 胶放置 时间对荧光强度的 影响
［ ］ ｈｒ ｊｎ Ｊ Ｇ ： １ Ｇ ｎ Ａ ｌ ｉ ｔ ｎ ｄ ４ Ｃ ｉｋｉ ， ． １８． ． ｉａ ． ９ ｅ ｍｐｆ ａ ｏ ａ ｉｃ ｉ ｎ Ａ ａ州 ， Ｖ ｌ １ Ｒ ｓｉｉ Ｅ ｄｎｃｅｓ， ｅｉ ｎｌ ， ｏ． ｅｒ ｔ ｎ ｎ ｏｕｌ ｅ Ｅｓｖ ， ｔｃｏ ａ ｌ － ｃｒ ｒ Ｈｏ ａｄ Ｉｃ， ８－８， ｅＮ ｔ ｏ ｈ ｌ ｎ ， ． ｐ． ２ ｌ ｎ ｐ １
１ ０ １
０８１ ． ． ０ ２ ３ ４ ６ ８ Ｏ－ ５ Ｌ
（ 三）负片上 Ｄ Ａ 错带的定组测定 Ｎ
将负片放在测微光度计的谱片台上，用二块玻 板将负片夹住， 乳剂面向上。将玻板固定， 调节 仪器使玻片处在水平状态。调节聚焦螺旋使谱 线全部清晰， 选用黑度标尺， 把狭缝对准负片未
Ａ Ｎ ＃） １－ Ｄ Ａ（ ｘ １ ｇ ０