流式细胞术临床检测项目操作流程
临床检测项目操作流程
1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定 3：CD55／CD59测定 4：血小板抗体测定 5：红细胞抗体测定 6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定
8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 9：XL操作步骤
淋巴细胞亚群测定
(CD系列)
方法
流式细胞仪(BD)
原理：
双/三色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜
上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从
而得到淋巴细胞亚群的百分数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴
细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK
细胞：CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出
淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采
集与处理
受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。

抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在 4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS
稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂
品牌规格贮存贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体1ML 2―8℃ 2：全血溶血
试剂
A：甲酸 70ML 室温 B：碳酸钠等
32ML 室温 C：多聚甲醛 14ML 室温
3：鞘液 20L 室温 4：清洗液
5L 室温 5：荧光微球 10ML 2-8℃
质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

样本制备：
1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2) 分别
向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟。

4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)。

5) 上机测样（可根据样本
情况选择洗或不洗上样。

操作性能
精密度批内五次重复CV<2％灵敏度500―1000个荧光素分子
参考值(百分数（绝对值）)
CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)
Th/Ts 1.05-2.03 临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关
节炎、
自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝
硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防
御疾病中起主要作用。

NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。

NK细胞也参与第二型
超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。

HLA-B27测定
原理：
双色直接免疫荧光法。

将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞
膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，
测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

样本制备：
1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2) 分别
向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟。

4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)。

5) 洗、离心、上机测样（备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结
果报告阴阳性参考值
阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。

临床意义
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体
整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具
有相关性，尤其是强直性脊柱炎。

CD55/CD59测定
原理：
双色直接免疫荧光法。

近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表
达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。

血细胞(红细胞和白细胞)通过
膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。

用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。

样本制备:
(一)白细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。

分别向二管中加入样品100ul。

2．溶血。

3．离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。

避光20-30分钟。

4．洗涤离心 5．上机测样
(二)红细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记
2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。

3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-
30分钟。

4．洗涤离心。

5．混匀、上机测样。

报告结果报告百分数参考值
CD55>97% CD59>97%
PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90%
PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒细胞CD59>84% 临床意义
用于AA和PNH的诊断和分型诊断。

PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。

血小板膜表面抗体测定
原理：
直接免疫荧光法。

FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行
分析。

操作：富集血小板法：
1）800r/min*15min,取上清，
2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。

3) 分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
4) 分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小
板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。

）。

5) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟 6) 洗或不洗，上机测样全血法：
1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）报告结果报告百分数参考值
IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% 临床意义
为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。

红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）
原理：
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