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[医学]流式细胞术的临床应用
FSC检测器
SSC检测器
实验诊断科 分子诊断组
外周血裂红后FSC/SSC分布 R1: 淋巴细胞 R2: 单核细胞 R3: 中性粒细胞 R4: 裂解碎片
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪检测什么信号?
荧光信号
抗原抗体反应 单克隆荧光抗体标记
抗原
激光束
细胞
抗体
荧光素
实验诊断科 分子诊断组
常用荧光素
不同的激光器搭配不同的荧光素,原理是激 发光波长有所不同
溶血
如果需要破坏 样本中红细胞:
加入1ml 红细胞裂解液 避光,10min
离心弃上清, 加入PBS,混 匀后离心,弃 去上清用400 l PBS充悬, 避光待上机。
洗涤 上机
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞术的临床应用
已开展的项目
淋巴细胞亚群 HLA-B27 CD55、CD59检测 CD34造血干细胞计数 白血病和淋巴瘤免疫分型 杂项(BALF、胸腹水等 CD分子检测)
数量的检测 采集时机的确定
某些肿瘤
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
白血病和淋巴瘤(L&L)免疫分型
试剂:各种单克隆荧光抗体 标本:骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织 检测指标:我室目前开展了将近40种指标的检测
可满足大部分L&L的分型要求
过滤、离心后制 成单细胞悬液,并调 整目标细胞浓度约 106/ml
骨髓、红细胞:
调整样本中目标 细胞浓度106/ml
抗体孵育
50~100l标本 (血小板1~5l)
+ 荧光抗体
室温,避光,抗 体孵育20min
(胞内因子检测 需置4℃)
胞 胞内抗原检测:
内 染 色
按照说明书加入固定剂、 破膜剂及胞内荧光抗体,避光 反应30~40min。
B细胞(CD19) NK细胞(CD3-CD16+56+)
实验诊断科 分子诊断组
实验室报告
医生报告
实验诊断科 分子诊断组
淋巴细胞亚群
临床意义:体内免疫状态 判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染
SCID、AIDS、 SLE、RA 急性GVHD、移植排斥、恶性肿瘤 免疫球蛋白缺乏症或分泌过多
结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变
流式细胞术的临床应用
流式细胞术介绍
流式细胞仪 常用荧光素 数据分析
实验诊断科 分子诊断组
什么是流式细胞术?
利用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)对处在快速、 直线、流动状态中的单个微粒多参数、快速定量分析, 也可以同时对特定群体进行分选的技术 分析对象包括细胞、细菌、荧光微球等,0.4m~40m
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
CD55、CD59
试剂:CD59-FITC、CD55-PE 标本:外周血(红细胞、白细胞) 检测指标:CD55、CD59百分比
CD55、CD59荧光强度实验诊断科 源自子诊断组CD55、CD59
临床意义:
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)
酸化血清溶血试验(Ham’s试验)
AIDS
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
HLA-B27
试剂:BD HLA-B27 Kit 标本:外周血 检测指标: T (CD3+)淋巴细胞上HLA-B27
定性检测
实验诊断科 分子诊断组
实验诊断科 分子诊断组
HLA-B27
临床意义:强直性脊柱炎(高度相关) 遗传性关节炎
Reiter’s 综合征 反应性关节炎、银屑病关节炎 急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、
实验诊断科 分子诊断组
蓝色-荧光微球(数量已知);红色-CD34+细胞
干细胞特征:
CD45表达弱→阴性 (R2) CD34表达弱→强 (R4) DNA/RNA含量多,染色性较强 (R1) 大小(FSC)和颗粒度(SSC)淋巴细胞相似
实验诊断科 分子诊断组
造血干细胞计数
临床意义: 血液系统疾病的造血干细胞移植
其他临床应用
TH1/TH2细胞检测 血小板活化 炎症感染指标CD64 CBA 网织红细胞/血小板检测 微小残留病灶(MRD) 肿瘤细胞倍体(DNA) 细胞凋亡
……
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
淋巴细胞亚群
试剂:BD IMK-Lymphocyte Kit 标本:外周血(常用) 检测指标:T细胞(CD3、CD4、CD8)
实验诊断科 分子诊断组
FCM的临床应用
标本染色的一般方法 已开展的临床项目 其他临床应用
实验诊断科 分子诊断组
标本染色的一般方法
标本来源:
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊 液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细 胞。
血清和各类体液样本(可溶性蛋白)
实验诊断科 分子诊断组
前期处理
CSF、BALF、胸腹 水等:
糖水试验
蛇毒因子溶血试验
补体溶血敏感实验
FCM检测(金标准)
实验诊断科 分子诊断组
以红细胞检测为例
normal
PNH
实验诊断科 分子诊断组
已开展的项目
造血干细胞计数
试剂:BD Procount™ Progenitor Cell Enumeration Kit
标本:骨髓、动员后的外周血 检测指标:CD34+%及浓度
计算机分析 实验诊断科 分子诊断组
BD FACSCalibur 双光源,488nm和633nm 可同时检测四种抗原 可分选(理论上)
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪检测什么信号?
散射光信号
前向散射光(forward scatter light, fsc ) 反映细胞大小
侧向散射光(side scatter light, ssc) 反映细胞内部颗粒、核膜等
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
设门(gating):
根据某些特性将分析细胞群 圈起来。
淋巴细胞:FSC/SSC CD45++/SSCdim
T淋巴细胞:CD3+/SSCdim
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
直方图
单参数分析 横坐标:信号强度 纵坐标:细胞数量
实验诊断科 分子诊断组
数据分析
散点图
双参数分析 横、纵坐标代表的均是信号强度 UL: cd3-cd4+ UR: cd3+cd4+ LL: cd3-cd4- LR: cd3+cd4-
实验诊断科 分子诊断组
什么是流式细胞仪?
六种技术:激光技术、电子物理技术、 光电测量技术、电子计算机技术、 细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术
四个系统:液流系统、光学系统、 电路系统、分析系统
实验诊断科 分子诊断组
流式细胞仪构造
包括流动室、 鞘液和样本流
激光源
滤光片 (长通、短通、带通)
信号检测器