实验四厌氧菌一、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌（一）目的要求1. 掌握破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的形态特点、培养特性和鉴别要点。

2. 熟悉破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的分离培养过程、鉴别的一般原则和常用方法。

3. 解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的外毒素毒性动物实验。

（二）器材和试剂1．菌种破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌菌种及其形态示教片。

2．培养基疱肉培养基、血琼脂培养基、牛乳培养基、五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵管、牛心脑浸液肉汤与琼脂、脂酶培养基。

卵黄琼脂、溴甲酚紫牛乳培养基。

3. 试剂革兰染色液（一套）、芽胞染色液（石炭酸复红、95％酒精、碱性美蓝）、焦性没食子酸、100g/L氢氧化钾、溴甲酚紫；产气荚膜梭菌抗血清、肉毒梭菌多价抗血清、索氏梭菌抗血清；2０g／L尿素L-色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4. 其他小白鼠、家兔、无菌注射器、无菌吸管、滴管、中、小试管、消毒纱布块；固体石蜡或凡士林、酒精灯、三角架、碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；剪刀、镊子、玻片、药勺、钯粒；厌氧袋、厌氧罐、离心机、水浴锅等。

（三）步骤和方法1．破伤风棱菌（1）形态观察观察破伤风梭菌示教片，其繁殖体型为革兰阳性细长杆菌，散在排列，芽胞型的芽胞呈正圆形，位于菌体顶端，直径大于菌体，使芽胞和菌体呈鼓槌状；该菌鞭毛为周身鞭毛。

（2）培养物观察破伤风梭菌在疱肉培养基中生长缓慢，厌氧培养2～7天后其生长现象为培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑，有少量气体。

生成的甲基硫醇、H２S等使培养物变臭。

破伤风梭菌在血琼脂平板上形成圆形、扁平的菌落。

菌落中心结实，周边疏松似―羽毛状‖。

菌落周围有α溶血环，培养时间延长可变为β溶血环。

（3）生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴锅中加热。

热煮沸10min，迅速冷却。

以无菌吸管吸取破伤风梭菌纯培养物，分别滴加。

于牛乳培养基与五糖发酵管中，接种毕，在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经37℃孵育24～48h，观察结果。

结果破伤风梭菌五糖（葡乳麦甘蔗）均不分解，牛乳培养基无变化。

‖（4）破伤风梭菌芽胞染色法①原理芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上后又难以脱色的特点设计的。

所以芽胞染色法都基于同一个原则，采用着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。

②方法：a.用破伤风梭菌培养物涂片，干燥，火焰固定；b.滴加石炭酸复红液于涂片上，用微火加热至染料冒蒸汽（切勿煮沸）维持3～5min，加热过程要随时添加染液，勿让标本干涸，待玻片冷却后，水洗；c.用95％酒精脱色30s～1min，水洗：④滴加碱性美蓝液复染30s～lmin，水洗。

⑤干燥后，镜检。

③结果：芽胞染呈红色，菌体染呈蓝色。

2. 产气荚膜梭菌(1)形态观察产气荚膜梭菌镜下检查为革兰染色阳性粗大杆菌，两端钝圆，散在或短链状排列；荚膜染色法可见肥厚荚膜；芽胞卵圆形，与菌体等宽，位于菌体中央或次未端。

(2)培养物观察产气荚膜梭菌在疱肉培养基中呈现混浊生长，肉渣呈粉红色，不被消化，产气甚多；在血琼脂平板上多数株有双层溶血环；高层葡萄糖琼脂培养管中，可见气体产生，使琼脂有断裂分层现象。

(3)生化反应①五糖发酵试验：将五糖发酵管置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。

以无菌吸管吸取产气荚膜梭菌纯培养物，分别滴加于五糖发酵管中，接种后，在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经35℃孵育24～48h，观察结果。

结果葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖均分解，产酸产气。

1汹涌发酵现象a.原理：产气荚膜梭菌能迅速分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，并产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲散形成分散的海绵状碎块，并将培养基表面的石蜡冲至试管塞处。

此为汹涌发酵现象。

b.方法：甩无菌吸管（或接种环）取产气荚膜梭菌疱肉培养物接种于溴甲酚紫牛乳培养基，置35℃孵育18～24h，观察结果。

c.结果和意义：一般于孵育6h后即可发生，产气荚膜梭菌迅速分解乳糖，产酸产气，酪蛋白被酸凝固，形成凝块与乳清，凝块被产生的大量气体冲击，形成分散的海绵状碎块，将部分培养基冲至试管口塞处。

这种气势凶猛现象，为本菌的重要特征之一。

③卵磷脂酶试验和奈格尔试验a.原理：产气荚膜梭菌能产生卵磷脂酶，在卵黄琼脂平板上，能将培养基中可溶性的磷脂酞胆碱分解生成磷酸胆碱和不溶性的二脂酞甘油酯，后者在菌落周围形成不透明区（有乳白色环），此为卵磷脂酶试验阳性。

奈格尔（Naglar）试验是抗原抗体中和试验用产气荚膜梭菌抗血清，实际是卵磷脂酶抗血清（抗体）涂在琼脂上，由于抗原（卵磷脂酶）抗体中和反应，使菌落周围不形成不透明区，即无乳白色环，则为奈格尔（Nag1ar）试验阳性。

这样可确证该菌能产生卵磷脂酶。

b.方法：将卵黄琼脂平板底部划分两个区，琼脂的一半均匀涂上产气荚膜梭菌抗血清，置37℃待干后，将待检细菌先在未涂抗血清区划线接种，然后在有血清区划线接种，置37℃厌氧孵育24～48h、观察结果。

c.结果：未涂抗血清的一半平板，菌落周围形成较大的混浊不透明区，表示卵磷脂酶试验阳性；涂抗血清的一侧，菌落周围无不透明区（无乳白色环），表示卵磷脂酶活性已被抗毒素所中和，为奈格尔试验阳性；如两侧菌落周围均无不透明区，表示该菌不产生卵磷脂酶。

产气荚膜梭菌卵磷脂酶试验为阳性，破伤风梭菌、肉毒梭菌为阴性。

(4)动物实验①原理：产气荚膜梭菌接种小白鼠腹腔后，可使小白鼠各脏器肿胀、并有许多气泡，尤以肝脏为甚，故又称为海绵肝或泡沫肝。

②方法：将产气荚膜梭菌培养液0．2～1．0ml注射小白鼠腹腔，5min后断髓处死，置37℃孵育5～8h，观察小白鼠腹腔是否膨胀有气肿现象，然后解剖小白鼠，观察各脏器，尤其是肝脏的变化。

③结果：剖检可见各脏器肿胀，并有许多气泡，尤以肝脏为甚，称海绵肝或泡沫肝。

如果取内脏组织涂片，革兰染色、镜检，可见具有荚膜的革兰阳性梭菌。

3.肉毒梭菌(1)形态观察肉毒梭菌为革兰染色阳性、两端钝圆的粗大杆菌，单独或成双排列；菌体的芽胞为卵圆形，宽于菌体，位于菌体次未端，使细菌呈―网球拍‖状；鞭毛染色可见周鞭。

(2)培养物观察肉毒梭菌在扈肉培养基中生长旺盛，呈均匀混浊，产生少量气体，肉渣被消化变黑色，看腐败性恶臭；在血琼脂平板上呈现半透明、有光泽、边缘薄、弥散而不规则的菌落，有β溶血环。

(3)生化反应①五糖发酵试验：将五种糖发酵管与牛乳培养基置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。

以无菌吸管吸取肉毒梭菌培养液，分别滴加于五糖发酵管与牛乳培养基中，接种后在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经35C孵育24～48h，观察结果。

结果：肉毒梭菌能分解葡萄糖，麦芽糖与蔗糖，不分解乳糖与甘露醇，牛乳培养基一般无变化。

②脂酶试验a.原理：肉毒梭菌能产生脂酶，它作用于卵黄中游离脂肪，产生甘油和不溶性游高脂肪酸，在菌落的周围形成局限的不透明区，并于菌落表面产生一层珠光层。

为一薄层脂肪酸，可与卵磷脂的分解产物（二脂酰甘油酯）区别。

b.方法：将肉毒梭菌接种于卵黄平板，置35℃厌氧孵育48～72h，观察结果。

c.结果：菌落表面有珠光层，菌落的周围有不透明区者为脂酶阳性，各型肉毒梭菌（G型除外）脂酶试验阳性，破伤风与产气荚膜梭菌该试验为阴性。

(4)动物试验①原理：肉毒梭菌培养液注入小白鼠腹腔后其毒素作用于颅脑神经核、外周神经肌接头以及植物神经末梢，使小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难，眼睑下垂，瞳孔散大、流涎，最后因心力衰竭或呼吸困难而死亡。

②方法a.准备滤液：取培养5天的肉毒梭菌液体培养物，离心3000r／min，30min，取上清经滤菌器除菌，取滤液作试验。

b.将动物分为三组：1组：取上述滤液0.5m1，注入小白鼠腹腔。

2组：同法注入加热100℃30mm 的滤液于第二只小白鼠，3组：第三只小白鼠在注射肉毒梭菌多价抗毒素的同时再。

注射不加热的滤液。

c.结果：注射后1小时（也有延至3～7天），第1组小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难、眼睑下垂、瞳孔散大、流涎等中毒症状，最后因心衰或呼吸困难而死亡。

剖检，内脏可见明显充血，大量出血与血栓形成等，第2乃组动物不发病，存活。

4.临床意义：破伤风芽胞梭菌又称破伤风杆菌，广泛存在于自然界，在土壤和人与动物的肠道中都有存在。

当机体受创伤时或新生儿接生时使用不洁用具断脐带，破伤风梭菌可侵入伤口生长繁殖，分泌外毒素，引起机体痉挛性抽搐，称为破伤风，新生儿破伤风又称为脐带风。

产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。

本菌可产生外毒素及多种侵袭性酶类。

此菌的致病条件与破伤风梭菌相同，主要是大面积创伤、局部供血不足，组织缺氧坏死，氧化还原电势下降）菌体产生芽胞，产生毒素和侵袭性酶，引起感染致病。

所致疾病主要是气性坏疽，某些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎，也常与兼性厌氧菌混合感染，引起深部脓肿，腹腔、盆腔、胸腔感染、败血症、心内膜炎以及胆道、泌尿道、女性生殖道感染等。

肉毒梭菌广泛存在于自然界，土壤中常可检出，偶尔存在于动物粪便中。

在厌氧环境中，此菌分泌极强烈的肉毒毒素，引起特殊的神经中毒症状，病死率极高。

本毒素尚可使婴幼儿感染与中毒。

本病与典型的食人肉毒毒素引起的食物中毒不同，属于感染性中毒。

5.注意事项(1)对预采集标本部位应首先清除污物、再用2％～2．5％碘酒75％酒精消毒，防止皮肤表面污染菌（需氧菌）混入标本而影响检测结果；所盛容器必须在用前进行灭菌。

(2)对不同部位的标本采集，应分别采取，如系瘘管应取部分坏死碎片，对闭锁性脓肿应以无菌注射器穿刺抽取脓汁和分泌物，取材后尽量排出注射器内空气，并将针头插入无菌橡皮塞内，避免空气进入。

(3)对厌氧菌的分离培养、鉴定的全过程中均应防止氧气进入。

二、艰难梭菌（一）目的要求1.掌握艰难梭菌的形态特点及培养特性。

2.熟悉鉴别艰难梭菌的一般原则和常用方法。

3.了解艰难梭菌毒素对动物的毒性试验。

（二）器材和试剂1.菌种艰雅梭菌。

2.培养基疱肉培养基、CCFA（环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、果糖、琼脂）平板培养基、卵黄琼脂培养基、五糖发酵管、七叶灵柠檬酸铁琼脂、20％胆汁心脑浸液、明胶培养基。

3.试剂芽胞染色液、焦性没食子酸、100g／L氢氧化钾、索氏梭菌抗血清、20g／L尿素、L一色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4.其他家兔、无菌注射器及针头、无菌吸管、滴管、中小试管、消毒纱布块；固体石蜡、酒精灯、三角架、消毒用碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水、剪刀、镊子、钯粒、产气袋、厌氧罐、水浴锅等。

（三）步骤和方法1.形态观察艰难梭菌为革兰阳性粗长杆菌；芽胞为卵圆形或长方形，位于次极端或极端、运动性菌株为周鞭毛。

2.培养物观察在CCFA平板上，经48h厌氧培养后，产生特征性马厩（horsestable）气味，菌落直径3～5rnm，圆形、略凸起、白色或淡黄、不透明、边缘不整齐、表面粗糙或毛玻璃样菌落。