实验3 酵母蔗糖酶的制备
一、实验目的
1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶
2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量
二、实验原理
酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。
三、实验器材
1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。
2、材料：啤酒酵母、
3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。
四、实验步骤
1 研磨水提取
(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。
(2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。
(3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。
(4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。
(5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。
(6) 将上清液转入量筒，量出体积。
用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。
（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。
2 热处理和乙醇沉淀
(1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。
(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
(3)将上清液转入小烧杯中，放人冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，缓慢地加入等体积预冷至—20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置l0min、以沉淀完全。
于4℃、10000r ／min，离心10min,倾去上清液，并滴干，沉淀保存于烧杯中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放人冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ )。
3 紫外吸收法测定蛋白质
（1）取待测样品（本实验提取的级分1和级分Ⅱ）置于石英比色皿中，紫外分光光度计280nm 和260nm出测定OD，用去离子水作为空白对照；
（2）根据下列公式计算样品中蛋白质含量
蛋白质含量（mg/ml）=1.55 OD
280-0.76 OD
260
五、实验思考
1. 为什么酶的提取需要低温操作? 2．热处理的目的是什么？
实验4 蔗糖酶的活性和比活力测定
一、实验目的
1、掌握酶活性测定的方法和原理
2、测定级分Ⅰ、Ⅱ的酶活性，学习酶比活力计算。
二、实验原理
1、蔗糖＋蔗糖酶（水解酶）→D-果糖＋Ｄ－葡萄糖
用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度。
本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应５min,每产生１mg葡萄糖所需的酶量。
２、DNS试剂＋Ｄ－葡＋强碱液中＋沸水浴生成氨基化合物（棕红色）
三、实验器材
1、试剂：葡萄糖2mol/L、蔗糖0.2mol/L、1mol/LNaOH、
DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g,溶于50ml蒸馏水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，，NaOH 21.0g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，
搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，室温保存。
2、仪器：分光光度计、水浴锅
3、材料：实验3所得级分Ⅰ、Ⅱ的蔗糖酶
四、实验方法
1．工作曲线的制作
取６只试管，按下表加入2.0mg∕ml葡萄糖标准液和蒸馏水
管号葡标准液∕ml 蒸馏水∕ml 葡含量∕(mg.ml)-1
１０１０
２ 0.2 0.8 0.4
3 0.
4 0.6 0.8
4 0.6 0.4 1.2
5 0.8 0.2 1.6
6 1.0 0 2
在上述试管中＋ＤＮＳ试剂２ml，沸水浴５min，流动水迅速冷却，各加蒸馏水９ml，摇匀，在540nm波长测光吸收值，以葡含量（mg∕ml）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．酶液的稀释（级分Ⅰ、级分Ⅱ）
各取0.2ml稀释10倍，得到2ml稀释液。
3．吸光度的测定
取２ml稀释后的酶液＋２ml 0.2mol∕L蔗糖，立即摇匀开始计时，35℃水浴５min,立即加入１ml1mol/LNaOH中止反应。
取1ml的反应液＋２ml DNS试剂，沸水浴５min，立即用流动的自来水冷却后，加入９ml蒸馏水，进行吸光度的测定。
4．计算酶的活力稀释后的酶活力→原始酶活力
（1）酶活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1个活力单位（U）
（2）计算级分Ⅰ、级分Ⅱ的比活力
比活力= 酶活力/1ml蛋白质的含量
注意事项：水浴温度，时间要精确
五实验思考
1、什么是比活力？测定比活力的意义是什么？
2、试分析级分Ⅰ、级分Ⅱ的比活力的高低和原因。