酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。
它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。
采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。
纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。
蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化Study on Purification of Invertase from YeastAbstractSucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development.This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast.The results of our study were followed:1、Purification of invertase from yeastThe specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%.2、Properties of sucraseThe kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min.Key words : yeast;invertase;extraction;purification第一部分文献综述蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。
除广泛分布于微生物、植物外，类似的活性也在动物的消化液中发现。
传统的酵母蔗糖酶的提取方法是甲苯自溶法，尽管此方法所用试剂简单、价格低廉，但由于其消耗时间长、重复性差、酶活性较低等缺陷，现已很少采用。
目前也有采用乙醇沉淀法和硫酸铵分级沉淀法制得的蔗糖酶，再用柱层析的方法提纯，由于柱层析工艺复杂，处于实验室探索研究阶段。
经查新，已见采用冻融法和SDS抽提法的文献报道。
文献说明，相对于甲苯自溶法，这两种方法提取的酶的活性要高出很多。
SDS抽提法对酵母蔗糖酶的提取效率比较高，是冻融法的2倍，但其中总蛋白量提取也较高，是冻融法的3倍，因此如果采用SDS法，对酵母蔗糖酶的纯化需要去除较多的杂蛋白本实验结合传统方法和新兴方法，寻找从经济和效率上最优的酵母蔗糖酶的提取工艺3.3图33.3.2图43.3.33.6.2 最适温度的测定在21℃～70℃范围内，设置一系列不同的温度梯度，分别测定各个温度梯度下蔗糖酶的活性，活性最高的温度即为蔗糖酶的最适温度。
表六3.6.3 蔗糖酶Km 及Vmax 的测定以蔗糖为底物，在最适条件下，分别设置不同的底物梯度，测定蔗糖酶催化蔗糖的反应速度，以1/[S]为横坐标，1/V 为纵坐标，按双倒数法作图，可以得到Lineweaver –Burk 双倒数直线方程，在1/V 纵轴的截距是1/Vmax,在1/[S]横轴上的截距是-1/Km ，求出Km 和Vmax ，双倒数方程如下：maxmax max 1][1][][1V S V K S V S K V m m +=+= 表七3.7 实验结果与分析 3.7.1 离子交换层析图酵母经过冻融法粗提蔗糖酶、硫酸铵分级沉淀后进行DEAE-Sephrose 离子交换层析。
其洗脱曲线如下图，蔗糖酶集中在稳定后一个小时至第二个小时之间。
其洗间。
图63.7.2蔗糖酶的分纯化计算各步的总蛋白、总活性、比活、回收率和纯化倍数，蔗糖酶比活力为947.805U/mg，最后纯化倍数为16.14倍，回收率为51.6%。
表八从上表可以看出，选用乙醇沉淀+冻融法和乙醇沉淀+SDS法是最优组合，但SDS法得到的酶液，容易随时间的改变而变化，见下表；这极有可能是因为，SDS为强的蛋白质变性剂，随着时间的变化，其对蛋白质的活性有很大的影响，这在酶的生产过程中对周期的要求就大大增加了，而冻融法却没有这种生产限制：表十3.7.3 蔗糖酶纯度鉴定图71——冻融法+硫酸铵分级沉淀法得到的酶液2——Marker（由Amersham公司提供）3——冻融法+乙醇分级沉淀法得到的酶液4——冻融法+乙醇分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液5——冻融法+硫酸铵分级沉淀法得到的酶液6——冻融法+硫酸铵分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液7——冻融法+乙醇分级沉淀法得到的酶液8——冻融法+乙醇分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液9——Marker（由TaKaRa公司提供）10——冻融法+硫酸铵分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液从上图可以看出，除了2号泳道和9好泳道有Marker条带，其余没有条带跑出。
初步认为，是由于上样量太少（10uml），但由于存样量不够继续加样实验。
3.7.4 酶促反应动力学研究3.7.4.1 最适PH值用不同PH值的缓冲液体系代替原来的缓冲液体系，然后按常规测定条件和方法测定酶活。
结果表明，酵母蔗糖酶在PH4.5的条件下活性最大（如下图所示）。
图83.7.4.2 蔗糖酶最适温度在一系列不同温度下测定蔗糖酶的活性，结果表明，蔗糖酶的最适温度在50℃左右。
（如下图所示）图93.7.4.3 蔗糖酶Km及Vmax在蔗糖酶的最适温度和PH下，测定不同底物浓度时的反应速度，按测定结果计算1/[S]和1/V，并按双倒数法作图，得到线性回归方程（如下图），求得蔗糖酶的Km为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为 5.98ug/min。
图10第四部分讨论4.1 蔗糖酶的分离纯化在进行实验之前，根据已有的文献报道和实验室现有的条件设计了一条常规的纯化路线，即粗提、分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析。
在本实验中经过DEAE-Sepharose 离子交换层析后，得到了纯的蔗糖酶。
酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法的，冻融法和SDS抽提法报道较少。
本实验中比较了上述三种酵母蔗糖酶的提取方法（见表八），可以看出SDS抽提法和冻融法的酶活性远高于甲苯自溶法的。
尽管甲苯自溶法所用试剂简单、价格低廉，但由于其耗时长、重复性差、酶活性低等缺陷，提取效率远不如其它两种方法。
通过对不同放置时间相同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较，可以看出（见表九），随着放置时间的增加，酶的总活力和比活力都大大下降了，而冻融法却不然（见表十），随着放置时间的增加，酶的总活力和比活力几乎没变，因此，SDS抽提法在提取酵母蔗糖酶的过程中对操作周期的要求要比冻融法要严格的多！综合各个资料中对几种物种蔗糖酶的分离纯化实验，一般都是通过乙醇分级沉淀。
乙醇分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加人与该溶液能互溶的溶剂，通过改变溶剂的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。
如在含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇,使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或丙酮可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来等。
与硫酸铵分级沉淀相比，该方法更简便易行，时间周期要求更短，且对操作温度没有限制，还可以有杀菌的作用。
离子交换层析是分离蛋白质应用最广泛的技术，蛋白质的两性特征意味着他们可以依PH值不同而呈阳离子或阴离子状态存在，与离子交换剂之间进行结合。