分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化
一、实验目的
➢ 学习蔗糖酶分离提取的原理
➢ 学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原理 与操作
二、实验原理 细胞破碎的方法
高压匀浆破碎法（homogenization）
பைடு நூலகம்
机械法
振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :
存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式
存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶
酵母细胞结构图
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min
（5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。
（6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。
（7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。
（8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。
酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶蛋 白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测 定。
酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及 收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电荷、 吸附等）进行分离; 同时用测定酶活力的方法了 解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
本实验由四个分实验组成：
✓蔗糖酶的提取与初步纯化 ✓蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定 ✓蔗糖酶各级分酶活力的测定 ✓离子交换柱层析纯化蔗糖酶
超声波破碎法（ultrasonication） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock）
冻融破碎法（freezing and thawing）
非机械法 酶溶破碎法（enzyme lysis）
化学破碎法（chemical treatment）
去垢剂破碎法（detergents）
✓ 蛋白质的沉淀
（9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。
➢乙醇沉淀
将粗酶液1转入小烧杯中，放入冰盐浴（碎冰、撒入少量 食盐），逐滴加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，同时轻轻搅 拌，共需30min；再在冰盐浴中放置10 min，使沉淀完全。 4℃、 10000 rpm离心10min，弃上清，并滴干，记录为“醇级 分2”，用5mL去离子水溶解后用于蛋白质含量和酶活力的测 定。
➢在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
比活力，每mg蔗糖酶所具有的酶活力单位
稀释后酶液的活力(按还原糖计算)：
E′=
A650nm×0.2×2 A’650nm×10×B
碱性铜试剂/ml
1
1
1
1
1
立即用90－95℃水浴加热7－8min，立即用自来水冷却。
磷钼酸试剂/ml
1
1
1
1
1
水/ml
5
5
5
5
5
A650nm E′=μmol/min.ml 原始酶液酶活力E单位/ml
(波长：650nm)
一个酶活力单位Units定义为在给定的实验条件下， 每分钟能催化1μmol蔗糖水解所需的酶量
➢ 实验材料：安琪酵母 ➢ 仪器和试剂:
研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯， 高速冷冻离心机， pH值试纸
二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸， 95％乙醇.
四、操作步骤
提取
（1）准备冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中 （2）称取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂)，放入研钵中 （3）用量筒量取30mL预冷的去离子水，先加5ml左右研磨 （若不够每次用滴管再加2mL左右水）， 边加边研磨成糊状 （至少用30 min），然后转移到100mL离心管中,最后用剩余 的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中，以便将蔗糖酶充 分转入水相中。
蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象
作用机制主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白 质所带的电荷
✓ 主要沉淀方法：
盐沉淀蛋白质——盐析
重金属盐沉淀蛋白质 某些酸类沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质 的水化层，使蛋白质的溶解度下降；另一方面 有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质 分子上不同电荷的引力，降低其溶解度，因此 使之发生沉淀反应。如把溶液的pH 值调节到该 蛋白质的等电点时，则沉淀更完善。
在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质往 往已发生变性。 若在低温条件下进行沉淀，则 变性作用进行缓慢。
➢利用机械法（二氧化硅研磨）破碎酵母细胞壁 ➢采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶 ➢离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液 ➢加热去除热不稳定的杂蛋白 ➢乙醇沉淀获得粗提酶。
三、实验材料、仪器和试剂
分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定 一、实验目的 掌握蔗糖酶活力测定方法
二、实验原理
蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每 摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解 速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数 量来测定。
蔗糖
葡萄糖
果糖
蔗糖酶
+
斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：
葡萄糖对照 葡萄糖
管数 稀释倍数
1
2
3
5
6
2000倍 5000倍/ 10000倍
酶液/ml
0.6
0.6
水/ml
0.6
1
0.8
HAC-NaAC缓冲液
0.2
0.2
0.2
2mmol/L葡萄糖/ml
0.2
0.2mol/L蔗糖/ml
0.2
0.2
0.2
加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂终止反应。
四、仪器
试管、试管架、移液管、分光光度计、 比色杯、水浴锅等
五、酶活力测定的步骤
1.粗酶液1 ，醇级分2 酶活力测定
（1）首先用去离子水稀释粗酶液1： 2000倍， 醇级分2： 5000、10000倍，（可取0.1mL加入 25ml刻度试管，定容25mL，即稀释250倍）
各管名称
对照
粗酶液1
醇级分2