一、目的要求
1．学习电泳原理和技术
2．学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
二、实验原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。

三、试剂与器材
试剂：10%SDS、30%凝胶贮液（29%ACr-1%Bis）、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质maker、0.25%考马斯亮兰R250染色液、甲醇：醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl（PH6.8）缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水
器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套、
四、实验步骤
1 SDS聚丙烯酰胺的灌制
⑴按说明安装玻璃板，橡胶条放在两玻璃板之间，确定不漏液，玻璃板放入电泳槽时，有凹槽的一侧向里，时刻保持玻璃片间的压力。

⑵根据表1制备分离胶溶液，加入TEMED后迅速旋转混合物，用1ml移液枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中（灌制红色板的上边缘）。

用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。

将凝胶垂直放于室温下。

（丙烯酰胺有神经毒性，故操作时应注意不要吸入其粉末，实验时应戴手套，剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔，待聚合后再处理）
⑶待聚合后（40min），倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部，尽可能倒掉凝胶上的液体，用滤纸吸干水分。

⑷按表1配置浓缩胶，加完TEMED后迅速旋转混合，注满玻璃板间隙，插入梳子（写有1.5mm 的一侧向里，先插入一侧，在从一侧向另一侧压着插入，以排除气泡）将胶垂直放置于室温下。

约30min聚合完成，拔出梳子（平行拔出），用去离子水冲洗胶孔，再用滤纸吸干水。

取出玻璃板，取下橡胶条。

表1分离胶与浓缩胶配制
2电泳
⑴样品处理将未加IPTG诱导的菌液37摄氏度摇至OD600=0.6-0.8左右，离心部分菌液分装，分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液，其余菌液加至0.5mM 浓度的IPTG 20摄氏度进行诱导10h，分装菌液离心后分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液。

⑵电泳槽中加入300ml电泳缓冲液，所有样品均需煮沸10min,然后用20μl加样枪依次加入IPTG诱导前的蛋白样品（20ul）、诱导后样品（20ul）、诱导前加DTT的（20ul）、和诱导后加DTT的（20ul）、蛋白maker，其余空加入等量的上样缓冲液。

（3）盖好盖子连接电源（红接红，黑接黑），慢慢调节电压至90V，进行电泳，待指示剂达到分离胶，把电压加到150V，至指示剂的红色条带移除胶体，停止电泳。

3染色、脱色
将胶取出，并在右上角切个角，以标记顺序，放入培养皿中加入约40ml染色剂，放在摇床上染色1h，倒掉染色剂，先用清水洗几次，倒掉清水，再把胶放入脱色液中，脱色一天，每隔3h换一次脱色液,最后把胶取出来沥干水，拍照。