lgMrlgKbmK1bm
常数 斜率
迁移率
通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量。
注意事项
1.SDS的纯度：市售SDS(A.R.)需重结晶后再用。 2.SDS与蛋白质的结合量：大多数1.4g SDS/g蛋白质
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个： (1)溶液中SDS单体的浓度 (2)样品缓冲液的离子强度 (3)二硫键是否完全被还原
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
混合样品
大分子
电泳方向
电泳 带孔胶
不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
小分子
按分子 大小分离
流程图
结果分析
1.相对迁移率的计算
相对迁移率mR =蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图
2.标准曲线的绘制
以每条Marker带的相对迁移率为横坐标，相应分 子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图
SDS－聚丙烯酰胺凝 胶电泳测定蛋白质
相对分子质量
概述
❖1967年由Shapiro建立。 ❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
实验原理
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5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白
质都能用SDS-PAGE测定其分子量。包括：电荷异常 或
构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些 糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
6.对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。
SDS-PAGE分类
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连 续 系统和不连续系统两大类： ❖ 连续系统：由电极缓冲液和分离胶组成。电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作 用下，主要靠电荷和分子筛效应。 ❖ 不连续系统：由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组 成。缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均 不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效 应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条 带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.凝胶浓度：应根据位置样品估计相对分子质量，
选择适当的凝胶浓度。测定蛋白质相对分子量时， 必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线 作为下次用。
4.多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚
基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋 白酶）组成的， SDS-PAGE测定的只是它们的亚基
或 单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。
1×105～5×105 ＞5×105
分离胶的浓 度
20%～30%
15%～20%
10%～15%
5%～10%
2%～5%
有不同的配制方法。（以不连续体系为例）
试剂名称
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液 （pH8.8Tris-HCl） 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.8Tris-HCl）
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基本原理
❖SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和
疏水作用，去多肽折叠。
❖巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫键，
因此使蛋白质分子处于伸展状态。 Байду номын сангаас 此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复
合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。
导致：
1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷 远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的 电荷差异。
2.00 2.00 2.00 2.00
11.8 10.20 8.54 7
5.20
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
2.00 4.60
2.分离胶的制备
胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速 聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
3.浓缩胶的制备
用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
实验步骤
一、制胶
1.配胶
配胶应根据所测蛋 蛋白质的相对分子量
白质相对分子质量范
的范围 ＜104
围选择适宜的分离胶
1×104～4×104
浓度。由于SDS-PAGE
4×104～1×105
有连续体系和不连续 体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而
相对迁移率
Native-PAGE和SDS-PAGE的比 较
与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程 中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：
1.凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性 凝胶有SDS。
2.样品缓冲液中非变性凝胶不仅没有SDS，也没有 巯基乙醇。
二、样品处理与加样
1.样品处理
样品 样品溶溶解液解 沸水浴 冷却
2.加样
小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用
微量进样器点样
三、电泳
加样
样品 迁移 方向
接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的 SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子 量的大小成正比变化。
这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移 率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是 椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
当蛋白质的分子量在15000～200000之间时 ，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分 子量的对数呈线性关系，符合下列方程：
量分 子
相对迁移率
3.未知蛋白质样品分子量的测算
计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线 上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。 如图
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。
未 知 蛋 白
SDS-PAGE测定蛋白质分子量示意图