聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。

在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。

聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。

凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。

②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。

一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100
万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。

③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。

凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。

④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。

合成聚丙
的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算：
公式
a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。

交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。

聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。

由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。

可通过下式计算来选择适当的凝胶网孔。

公式
式中：P为网孔平均直径，C为多聚体浓度，d为该多聚体分子直径（若不是卷曲的分子应为5A），K为常数，K值取决于涨胶的几何构型，假如多聚体的链是以近似于直角交联的，则约为1.5根据此式，我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径，例如已知多聚体浓度为5%，其网孔平均直径应为：
公式
除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。

1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。

当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。

由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS 复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。

蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
一、实验目的
1．了解电泳实验原理
2．掌握电泳实验操作规程
3．用电泳方法测定蛋白分子量
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
二、实验原理
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Dav is(1964) 设计的,样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。

系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。

样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。

此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。

从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物
lgM w = lg K －bm =K1－bm (2) 其中M w是蛋白质分子量；K和K1为常数
b为斜率，m 是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率m R。

如果用几种标准蛋白质分子量的对数作纵坐标，用各自的相对迁移率作横坐标，即可画出一条斜率为负的标准曲线。

相对迁移率为：
其中，d pr、d BPB分别为样品和BPB（溴酚兰）以分离胶表面为起点迁移的距离。

欲求未知蛋白的分子量，只需求出它的相对迁移率：
m R未=d pr未/d BPB
然后，从标准曲线上就可求出此未知蛋白的分子量。

取出脱色后的凝胶平放在两块透明投影胶片中间，赶尽气泡，在复印机上复印。

在复印的凝胶图上用直尺分别量出各条蛋白带迁移的距离d pr和d BPB（以蛋白带的上沿或中心为准），计算相对迁移率，根据方程式：
lgM w = K1－bm R
用各标准蛋白分子量的对数（纵坐标）和相对迁移率m R（横坐标）画出标准曲线，由标准曲线再求出其他各条待测和未知蛋白带的分子量，如有可能计算其误差
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳--生物秀PCR技术
【实验试剂和器材】
（一）试剂
1. 制备分离胶、浓缩胶有关试剂
（1）凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺1 g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

（2）pH8.9分离胶缓冲液： Tris36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

（3）pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

（4）TEMED（四乙基乙二胺）原液
（5）10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
2.pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液
称取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

3. 50%(v/v)甘油
4. 1%(w/v) 溴酚蓝：称取100mg溴酚蓝，加蒸馏水10ml，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。

5.5×样品缓冲液（loadingbuffer）：10ml
3.1ml1mol/L Tris-HCl(pH6.7) 312.5mmol/L
5ml 50%(v/v)甘油 25%
0.5ml1% (w/v) 溴酚蓝 0.05%
1.4ml 蒸馏水
4. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200m l蒸馏水中，慢慢加入7.5ml
70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法。