一、稀释引物
1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）
2、根据OD值加DD水。

3、静置30min（冰上）
4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。

5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。

二、跑MIX检测引物（20ul体系）、
上引物0.8ul
下引物0.8ul
Mix 10ul
DNA（日本晴）1ul
DD水7.4ul
三跑高保真酶（50ul体系）
DNAorCDNA 2ul
上引物2ul
下引物2ul
5*buffer 10ul
dNTPs 5ul
DD水28ul
Pfu（最后加）1ul
四胶回收流程
1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。

2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。

3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。

4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。

5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）
6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。

7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。

8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。

五、胶回收产物检测（10ul）体系
上引物0.4ul
下引物0.4ul
Mix 5ul
回收产物1ul
DD水 3.2ul
六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）
胶回收产物 3.5ul
Blunt cloning 0.5ul
混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃
之后转化
1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。

2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。

3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。

4、加入900ulSOC培养基，混匀。

5、37℃，160r摇床1h，使细菌复苏。

6、取出后离心3000r，2min。

7、吸出上清，留下100-150ul左右冻在LB 100ml+kana或者A 固体培养基上。

8、涂板，37℃过夜培养。

9、挑单菌落（一般不超过7个）加入到10ul的DD水中。

菌液PCR体系（10ul体系）
上游引物0.4ul
下游引物0.4ul
Mix 5ul
菌液1ul
DD水 3.2ul
之后跑电泳，若有目的条带则继续。

七摇菌
菌液+LB液体（加抗生素）-------L管（过夜摇菌）
第二天500ul菌液+500ul甘油混匀保存2管，其中一管送检，另一管-70℃保存。

若检测结果正确
八、提取质粒
1、在1.5ul的EP管中收集菌液，10000转，1min，弃上清，重复一次。

2、加205ul solution I（提前预热），用枪头打匀，室温静置2min。

3、加250ul solution II（提前预热），混匀，室温静置2min。

4、加350ul solutionIII，混匀，室温静置2min（有白色丝状物产生）
5、13000转，10min，取700ul上清液于吸附柱中，10000转，1min。

6、加500ul HBbuffer，12000转，1min，倒掉废液。

7、加700ul DNA wash buffer，13000转，1min，倒掉废液，重复一次。

再空离心2min 13000转。

8、37℃烘箱中干燥5分钟，加50ulDD水溶解，静置2min，离心13000转，2min。

九做酶切（50ul）
DD水19ul
K-B 5ul
质粒20ul
bamI 3ul
HIndIII 3ul
之后37℃烘箱，不超过16h
十、加5ul lodding buffer
若有条带胶回收。

十一胶回收（步骤同四）
十二做连接，连接表达载体
目的基因（胶回收的）4ul
载体（1300）1ul
DD水2ul
Buffer 2ul
T4连接酶1ul
过夜16℃，水浴连接。

十三、连接后转化，同“六”
十四、挑条单菌落
跑菌落PCR，若有条带，将剩下的9ul +LB液体+K 加入L管过夜培养。

十五、取L管500ul与500ul 甘油加入EP管中，并与-70℃保存
将L管剩下的菌液取1ul跑菌落PCR（10ul体系）
跑电泳检测结果。

十六提质粒
十七酶切检测
DD水7ul
K-B 1ul
质粒1ul
BamI 0.5ul
HinIII 0.5ul
37℃2.5h后可以检测。