单核细胞培养DC的过程
1.PBMC的分离 静脉采血40ml，以2：1体积比加于用淋巴细 胞分离液液面，离心分离PBMC，500g，20min。 小心吸取富含单个核细胞的细胞层，以1：5体积比，用RPM11640洗涤细胞三次：650g，10min；300g，10min两次。 2.MCM的制备 IgG包被培养皿：取6ml10mg/ml人IgG加入 10cm的培养皿，静置1h后吸尽液体，用RPMI-1640洗平板两次。 将上述方法分离所得PBMC5×107/8ml，加入平板，37℃静置 2h，洗去非贴附细胞，再加入8mlRPMI-1640，37℃，培养24h。 离心收集培养液，0.2μm滤头过滤，分装，-20℃保存备用，工 作浓度25%。
分化与成熟
DC的产生分两个阶段：从祖细胞分化为未成熟DC和未成 熟DC受外界刺激分化成熟。
DC的分化体内DC起源于多能造血干细胞，按来源其分化 途径分为两条：①髓系分化途径。称为髓系DC，最终分 化为朗格汉斯细胞和间质DC两个亚群；②淋巴系分化途 径。为淋巴系DC，最终分化为类浆细胞DC。
髓系DC的分化发育分为4个阶段：前体阶段、未成熟DC、 迁移期和成熟DC，不同分化阶段的DC功能不同。DC前体 经血循环进入非淋巴组织，分化为未成熟DC，未成熟DC 具有很强的摄取、处理和加工抗原的能力。DC在摄取了 抗原后迁移到次级淋巴组织，在此过程中DC也随之成熟。
正常情况下，体内多数DC处于未成熟阶段，其广泛分布 于全身各外周组织，高表达吞噬相关受体，而不表达或 低表达共刺激分子和黏附分子。 未成熟DC有较强的抗原内吞和加工处理能力，而激发混 合淋巴细胞反应能力较弱。经过抗原摄取、炎性因子活 化等一系列过程，DC由未成熟转变为成熟，成熟DC则高 表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和黏附分子，CD83、 CD25为成熟DC的特征性标志。 成熟DC的抗原呈递能力及体外激发混合淋巴细胞反应的 能力强，而抗原摄取能力弱。DC的成熟过程同时伴有迁 徙，在外周组织中摄取抗原后，通过延长树突状突起， 改变趋化因子受体表达等方式进入淋巴结及淋巴管中成 熟，并激发T细胞反应。
该类细胞归纳起来具有以下特点： 第一，该细胞存在于脾脏白髓质，在外周淋巴结和肠系淋巴结 中均有发现； 第二，该细胞呈不规则形态，体积比T/B淋巴细胞大，缺少溶酶 体、高尔基体以及组织细胞具有的微丝管，最明显的是细胞向 四周伸出长短粗细不一的“伪足”； 第三，该细胞不分裂，不具备胞吞的能力； 第四，该细胞来源于骨髓而非胸腺，细胞表面高表达MHC分子； 第五，该细胞能引起强烈的混合白细胞反应，引起T细胞聚集， 促进T细胞活化与分裂，其效应比巨噬细胞或B细胞高几十甚至 上百倍。 根据这些特点，Steinman将这类细胞命名为树突状细胞 （dendriticcell，DC）并推测可能与抗原提呈有关。
DC与肿瘤免疫
人体的抗肿瘤免疫流程：①肿瘤相关抗原的摄取与呈递； ②激活肿瘤相关抗原特异性T细胞；③引导肿瘤相关抗原 特异性T细胞至肿瘤部位，杀灭肿瘤细胞。
机体抗肿瘤免疫主要依靠细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的免疫应答来杀伤肿瘤细胞，CTL并 不能识别完整的肿瘤抗原分子，只能特异性地识别来源 于肿瘤抗原亲本、由MHC分子呈递的抗原多肽。在大部 分恶性肿瘤中，肿瘤细胞表面的MHC抗原肽、共刺激分 子和黏附分子表达较低，不能有效地诱导T细胞活化，故 需要抗原呈递细胞的协同作用。
形态与功能
DC因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名
功能最强的APC
DC最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞增殖，而巨噬 细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞，因此DC是 机体免疫反应的始动者，在免疫应答的中具有独特地位。 DC对抗原和弱抗原都有很高的呈递效率，只需 少量的抗原及DC即可激活T细胞。 未成熟的DC可能诱导免疫耐受，体外激发混合淋巴细胞反 应（MLR）的能力较弱，但具有极强的摄取和加工处理抗 原的能力；成熟的DC能够诱导免疫激活，其抗原提呈能力 是巨噬细胞和B细胞的100~1000倍，同时激发MLR的能力 很强，但抗原摄取能力大大下降。
未成熟DC与成熟DC的比较
未成熟DC和成熟DC在形态学、表型等方面都有很大的不同。 形态学方面，未成熟DC呈葡萄串样半贴壁生长，细胞表面 褶皱多，毛刺样突起少；成熟的DC集落分散，悬浮生长， 细胞边缘有明显的毛刺样突起。
表型方面，未成熟的DC仅表达低水平的MHC分子、协同刺 激分子（CD80、CD86）和黏附分子（CD40、CD44、 CD54）等；成熟DC则表达高水平的MHC分子、协同刺激 分子和黏附分子、整合素（β1、β2）及特征性标记（CDla、 CD11c、CD83）等，并能分泌IL-12、IL-2l、IL-26、IL-28、 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IFN-α等细胞因子。
DC的历史
抗原提呈细胞摄入抗原并将其加工处理，被主要组织相 容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）捕 捉并以抗原肽-MHC复合物的形式表达于细胞表面，是激 活适应性免疫的基础，MHC分子在巨噬细胞和B细胞上 检测到表达，因此它们曾被认为是主要的抗原提呈细胞， 但是Ralph Steinman的发现彻底颠覆了这一观点。 1973年至1980年，Steinman连续发表了一系列的论文，详 细报道了一类新的细胞的发现。
未成熟DC具有极强的内吞能力，通过膜皱缩和形成大囊泡， 形成液相内吞作用，可使极低浓度（10～10mol/L）抗原得 到呈递，也可通过受体介导对糖基化抗原进行内吞。
在与T细胞的互动中，除提供MHCⅡ类分子/肽复合物的第一 信号外，还高表达B7-1、B7-2、CD40分子，为T细胞提供充 足第二信号，来促进T细胞的激活。 DC还可以增强体液免疫：一方面，DC通过促进抗原特异性 CD4+Th的产生，促进抗体生成；另一方面，DC直接作用于 B细胞，促进免疫球蛋白的分泌。
肿瘤微环境
虽然DC有强大的抗肿瘤作用,但实际在患者体内的效果却 不尽如人意,这可能与肿瘤的微环境诱导了免疫耐受的出 现有关。 肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展过程中扮演了重要角色。 由于肿瘤细胞、免疫细胞及其他间质细胞相互作用,并产 生多种免疫抑制性因子,从而营造了免疫抑制性肿瘤微环 境,抑制机体的免疫系统,促使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监 控,最终导致肿瘤的生长和转移。肿瘤微环境能够影响DC 的募集、分化、成熟和生存,抑制DC提呈抗原和激活T细 胞,造成宿主免疫系统对肿瘤抗原的无应答从而发生免疫 耐受。在这些机制中,调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg) 及JAK2/STAT3通路起到了重要作用。
3.DC的培养 用RPM1-1640重悬细胞，调细胞密度为 1×106/ml，加入12孔板，每孔4×106，37℃静置2h，轻轻吹 打，悬浮非贴壁细胞，弃去。 再用预热的RPM1-1640轻洗培养板两次，部分标本用75cm2培 养瓶过夜培养或4℃低温培养液收集悬浮细胞，再转入24孔板 培养（间接贴壁）。 加入含10%FCS完全培养基，2-巯基乙醇（浓度为5×10-5M）， rhIL-4，rhGM-CSF各1000U/ml，37℃，5%CO2，培养5～7d收 获未成熟DC。 部分培养自第7d始加入单核细胞条件性培养液（MCM）或 TNF-α（100Ug/ml）第11～14d收获成熟DC。
Steinman的观点最开始受到广泛的质疑，但Steinman顶住 压力坚持了下来。随后的10年时间里，DC被许多其他的 实验室观察到，并被证实以未成熟DC或前体细胞的形式 广泛存在于各种组织和器官中，尤其在皮下、粘膜层以及 血液中。这些细胞体积较小，缺少“伪足”，表达较低水平 的MHC分子，较高水平的Fc受体和补体受体，具有强烈的 吞噬能力，像“哨兵”一样实时监视着入侵宿主的病原微生 物。一旦检测到病原微生物，这些细胞立即启动吞噬和加 工过程，大量合成MHC分子，趋化因子受体，辅助激活因 子以及细胞因子，同时细胞启动成熟程序，体积增大，伸 出“伪足”，迁移至淋巴结或脾脏，激活适应性免疫。 2011年，Steinman因在“树状细胞及其在适应性免疫系统 方面作用的发现”，获得诺贝尔生理学或医学奖。
DC可以通过多种机制发挥其抗肿瘤免疫作用。 (1)激发细胞免疫。在肿瘤患者体内,DC可以直接向CD8+T 细胞提呈肿瘤抗原,诱导CTL反应。 (2)激发体液免疫。一方面,DC可以促进抗原特异性CD4+ 辅助性T细胞(helperTcells,Th)的产生,启动CD4+Th11668相 关免疫应答;另一方面,DC还可直接作用于B细胞从而促进 免疫球蛋白的分泌。 (3)自分泌或诱导其他细胞分泌多种细胞因子或趋化因子。 (4)DC可以与肿瘤细胞直接接触而抑制其生长。 (5)肿瘤抗原致敏的DC可释放一种具有抗原提呈能力的囊 泡小体,该小体内含有大量MHCI、II类分子和共刺激分子, 能显著刺激抗原特异性CD8+T细胞增殖,并诱导抗原特异 性CTL反应。
DC-CIK
DC细胞可有效地诱导静止T细胞增殖和应答，促进细胞毒性T 细胞和辅助性T淋巴细胞的生成，启动并参与免疫应答。同时 还是CD8+CTL和CD4+T细胞介导的原发性和继发性免疫反应 的最强的激发者，可有效地抑制肿瘤逃逸。CIK细胞兼有T淋 巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞MHC限制性杀瘤的特 点，是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高的广谱抗瘤免疫活 性细胞。在杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫功能方面有一定的 效果，能一定程度上降低肿瘤复发和转移。 CIK细胞虽然兼具肿瘤特异性及细胞毒活性，但其远期治疗效 果较弱，而DC则具有远期疗效明显的优势，故DC与CIK共培 养后形成的DC-CIK既有CIK的非MHC限制性抗肿瘤作用，也 有DC的MHC限制性细胞毒作用，提高了免疫杀伤特异性，实 现了近期与远期效果并重的目的。
调节性T细胞
调节性T细胞是一类具有免疫负调控功能的T细胞亚群，该类 细胞通过细胞直接接触和分泌调节性细胞因子发挥抑制效应， 逃避自身免疫反应，从而使少量的恶变细胞逃避免疫监视和 免疫防御，导致肿瘤的发生发展。有研究发现，肿瘤患者外 周血中的CD4+CD25+调节性T细胞明显增多，而且 CD4+CD25+细胞水平越高，预后越差。CD8+CD28-T细胞是 近年来被证实的另一种重要的调节性T细胞，这种T细胞在肿 瘤患者的外周血中也大量增多，体内外实验均证实，其具有 较强的免疫抑制作用，可抑制机体产生保护性抗体。然而， 完全清除具有免疫抑制作用的调节性T细胞会引起各种严重 的自身免疫反应。因此，纠正患者机体内环境的免疫失衡， 降低肿瘤患者体内调节性T细胞水平，保持机体免疫稳态， 是治疗肿瘤的关键之一。