操
作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 HBSS PBS 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 4. 37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
从组织获取淋巴细胞
淋巴节、扁桃体、 淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松
散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤 容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、 便可。 便可。
方 法：
1. 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 将样本置于陪替氏培养皿，加入 ； 2. 将样本切成 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离； 大小，用镊子将其分离； 3. 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。
方
法：
1. 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块； 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块； 2. 加入10ml胶原酶溶液，37ºC CO2培养箱孵育30分钟； 加入10ml胶原酶溶液， 培养箱孵育30分钟 分钟； 胶原酶溶液 3. 滤网过滤； 滤网过滤； 4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。
其他类型细胞
在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不 在组织中提取细胞通常使用酶消化法。 酶消化法 同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消 同组织处理方法也各异， 化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、 化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、 鼠上皮细胞。 鼠上皮细胞。
0.001 g s/n = 3.2
auto
60
Signal to Noise
50 40 30 20 10 0
TITER
0
1
2
3
Байду номын сангаас
4
5
6
Dilution
孵育、溶血、固定
• 抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞 抗体孵育：室温下避光 分钟 某些情况下如： 分钟（ 内因子检测需冰育） 内因子检测需冰育） • 溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页） 溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页） • 样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间 样本溶血后需立即上机检测，
材
1. 解剖刀
料
2. 0.15%胰蛋白酶 胰蛋白酶 3. Hanks’s缓冲盐或 缓冲盐或PBS，pH7.3 缓冲盐或 ， 4. 不含 、Mg离子的 不含Ca、 离子的 离子的HBSS 5. II型胶原酶 型胶原酶 6. 1%BSA或5%FBS 或 7. 5ml的吸样管 的吸样管 8. 35um尼龙滤网 尼龙滤网 9. DNase
APC
• 激发光633nm， 发射光660 在配有双激光的流 式细胞仪上，此荧 光染料与FITC、PE、 PE-Cy5联用做四色 分析。但现在因单 激光四色可实现， 故使用该染料意义 不大。
核酸染料
染料 Propidium Iodide Ethidium biromide 7-Aminoactinomycin D Acridine Orange Chromomycin A3 Hoechst 33342 DAPI Pyronin Y Thiazole Orange YO-PRO-1 TO-PRO-3 LDS 751 激发光 发射光 639 495342 637 493320 647 546 503 530(DNA) 640(RNA) 580 430 450 395 456 372 565 545 533 509 661 642 661 642 712 543 光源 488 488 514488 488 457 UV UV 514488 488 488 630 488
样本处理标准试剂： 样本处理标准试剂：
一、10%Bovine Serum Albumin BSA
1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中 2. 4ºC，20000 g离心30分钟 3. 分装后-20ºC保存
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
样本处理
抗体染色一般方法
目标细胞数量及检测终浓度： × 目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml
• 外周血白细胞分析：100ul全血 • 血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量） • 红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使 用） • 骨髓：100ul • 其他样本，计数后决定使用体积
可用的抗凝剂如下： 可用的抗凝剂如下：
EDTA： 2mg/ml ： 枸椽酸钠： 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml 肝素：
标本处理时间：
新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析 样本固定方法： 样本固定方法： 1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。
操 作
1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释； 2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma)； 3. 室温下700g离心30分钟； 4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出； 5. 加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟； 6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。
其他标本： 其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。 行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。
制备大鼠肾脏浸润细胞
材料： 解剖刀、 材料： 解剖刀、CO2孵育箱、滤网 孵育箱、
以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清） 胶原酶的细胞培养液（无血清） 以及含 胶原酶的细胞培养液
化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有： 注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸 为主的溶血剂（ ），基于 为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于 ），基于NH4CL的BD 的 公司的FACSLyse溶血剂。 溶血剂。 公司的 溶血剂
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地 ？？？，在流式细胞仪上可清楚地 优点：溶血时间快？？？，
PE-Cy5 TC
• 激发光488nm, 发射光667nm 为复合荧光素，荧 光激发较率较高， 信号强
FTIC、PE、PE-Cy5三 者为流式细胞最为常的 荧光，并经常将三者共 同使用进行三色分析
PE-Cy7
• 激发光488nm， 发射光767nm • 为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳 • 与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光 谱之间影响较小
将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。 将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。
缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响， 缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，
随时间细胞形态变化大。 随时间细胞形态变化大。
方法二： 方法二：密度离心法提取单个核细胞
Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠 泛影酸钠) 为 与 泛影酸钠 混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒 混合物，其密度为 ～ 。 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆 ～ 的血浆 以下的血浆层中。 层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。 而单个核细胞则在 以下的血浆层中
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
富集白细胞
方法一： 方法一：溶血法
1. 抗凝全血； 取100 ul抗凝全血； 抗凝全血 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂 混匀； 溶血剂,混匀 溶血剂 混匀； 3. 室温孵育 分钟； 室温孵育10分钟； 分钟 4. 4ºC，400g离心 分钟。去上清，加入 ， 离心10分钟 离心 分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； ； 5. 4ºC，400g离心 分钟。去上清，加入 ， 离心10分钟 离心 分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； ； 6. 4ºC，400g离心 分钟。去上清，调整细胞浓度至 ， 离心10分钟 离心 分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。 。
细胞培养
许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。 许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细 胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。 胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。 准备单细胞悬液 1.仪器和试剂： 仪器和试剂： 仪器和试剂 0.25%r EDTA,pH 7.2 0.25% 的胰酶 10%血清的培养液 血清的培养液 2.方法： 方法： 方法 a. PBS洗涤细胞； 洗涤细胞； 洗涤细胞 b. 加入 加入0.25%有胰酶，37ºC处理 有胰酶， 处理2~8分钟； 分钟； 有胰酶 分钟 c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。 血清的培养液。 血清的培养液 d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为 ×106/ml 的细胞悬液。 液洗涤细胞， 的细胞悬液。 液洗涤细胞 最后配成终浓度为1×
流式细胞仪标本处理一般原则及方法 流式细胞仪使用一般方法及技巧
李爱军 渭南市中心医院检验科
第一部分
流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法
标本来源： 标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。 根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。 不同的抗凝剂