溶液中加入一定量的中性盐如[NH4]2SO4 A 由于 [NH4]2SO4的亲水性比蛋白质亲水性大，能与大 量的水分子结合，使蛋白质表面水膜退化、消失； B [NH4]2SO4解离，中和了蛋白质颗粒所带的电荷，破 坏蛋白质表面电荷层而沉淀析出
（二）有机溶剂沉淀蛋白质： • 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂， 如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。 • 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的 介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 • 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性， 有机溶剂浓度不能太高 (30%-50%) ，而且 需要在低温条件下进行。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
Ion exchange chromatography 离子交 换层析（3）
Ion-exchange chromatography exploits differences in the sign and magnitude of the net electric charges of proteins at a given pH. The column matrix is a synthetic polymer containing bound charged groups; those with bound anionic groups are called cation exchangers, and those with bound cationic groups are called anion exchangers. Ion-exchange chromatography on a cation exchanger is shown here. The affinity of each protein for the charged groups on the column is affected by the pH (which determines the ionization state of the molecule) and the concentration of competing free salt ions in the surrounding solution. Separation can be optimized by gradually changing the pH and/or salt concentration of the mobile phase so as to create a pH or salt gradient.
Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析 （4）
• 测定分子量的原理和方法 物质分子的分子量大小与洗脱体积(Ve)有关, 反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子 量。 1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。 测定其Ve和V0值。 查标准曲线。
Stabilization of proteins 蛋白质的稳定
• 防止蛋白质变性或失活。 • 措施： 1）缓冲pH； 2）低温；<250C,一般40C; 3) 加蛋白酶抑制剂;
Assay of proteins 蛋白质的检测
• 纯化过程中,不断检测目的蛋白质的存在和 纯度变化。 酶：检测其催化产生的产物。 非酶蛋白质：检测其生物学效应，如抗原抗 体反应。
（一）盐析：
•在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的 胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 •依据：大多数蛋白质在高盐浓度时溶解度降低。 • 盐析对样品有浓缩作用。
• • • •
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫 酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
• 凝胶过滤层析(分子排阻层析，分子筛层析): 以具有 分子筛效应的颗粒状多孔网状物质为支持物,根据分 子大小和形状不同分离物质的技术。 • 基本原理：大的分子不能进入多孔凝胶颗粒内部，从 颗粒间隙穿过，行程短，被先洗脱下来；较小的分 子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折，行程长， 后洗脱下来。
Size-exclusion chromatography, also called gel filtration, separates proteins according to size. The column matrix is a cross-linked polymer with pores of selected size. Larger proteins migrate faster than smaller ones, because they are too large to enter the pores in the beads and hence take a more direct route through the column. The smaller proteins enter the pores and
Ion exchange chromatography 离子交换层析（4）
• 举例：
现有一蛋白质混合物（甲，pI=5.5; 乙, pI=7.2; 丙, pI=8.0）。拟用阳离子交换柱层析 分离，且在pH6.5的条件下上样。试预测交换吸 附的情况。若用NaCl梯度或pH梯度洗脱，请预测 洗脱顺序。 1) pH6.5时, 甲-,不交换; 乙+,丙+,交换; 2)盐梯度洗脱时, 乙+的净正电荷较少(或正电 荷密度较小),结合较松，先洗脱下来。丙+的净正 电荷较多，结合较紧，后洗脱下来。 3）pH梯度洗脱时，乙仍先洗脱下来，因为洗 脱液pH从6.5不断往上升时,最先达到乙的pI,使其 净电荷为零,从而解吸附。
Affinity chromatography 亲和层析（1）
•亲和层析：利用蛋白质与配体的特配体（ligand）：能被生物大分子识别并与 之结合的原子、原子团和分子。 • 基本原理和操作 1）将配体共价结合于惰性多孔载体上（即 固定化）；灌装制成亲和层析柱。 2）让蛋白质混合物流经层析柱，使目的蛋 白与配体结合。用缓冲液充分流洗，洗去不 结合和非特异结合的杂蛋白。
（三）层析：
• 层析（ chromatography) 是一种利用混合
物中各组分理化性质的差异，在相互接触
的两相（固定相与流动相）之间的分布不
同而进行分离分析的技术方法。
• 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层
析，吸附层析及亲和层析等。
Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析（1）
蛋白质的分离与纯化
纯化目的: 研究其结构、组成、性质和功能等。 纯化方法的依据：蛋白质的基本性质
1）溶解性：盐析等。 2）分子大小和形状：凝胶过滤（分子筛过滤）， 透析，超离心，超滤等。 3）电荷（酸碱性质）：电泳，离子交换层析，等 电聚焦等。 4）吸附性质：吸附层析，疏水互作层析。 5）特异结合亲和性：亲和层析。
The proteins retained on the column are those that bind specifically to a ligand cross-linked to the beads. (In biochemistry, the term “ligand” is used to refer to a group or molecule that binds to a macromolecule such as a protein.) After proteins that do not bind to the ligand are washed through the column, the bound protein of particular interest is eluted (washed out of the column) by a solution containing free ligand.
A modern refinement in chromatographic methods is HPLC, or high-performance liquid chromatography. HPLC makes use of high-pressure pumps that speed the movement of the protein molecules down the column, as well as higher-quality chromatographic materials that can withstand the crushing force of the pressurized flow. By reducing the transit time on the column, HPLC can limit diffusional spreading of protein bands and thus greatly improve resolution.
are slowed by their more labyrinthine path through the column.
Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析（2）
•
几个重要参数: 某一溶质组分的洗脱体积:Ve 凝胶床总体积: Vt 凝胶自身的体积: Vm 颗粒内部的水体积(内水体积): Vi 颗粒外的水体积(外水体积): V0 四者关系: Vt =Vm+Vi+V0
• 有的方法利用了蛋白质几个方面的性质。 • 一般要连续采用多种方法才能达到纯化的目的。
Selection of protein source 蛋白质原料的 选择
• 选含“目的”蛋白多的原料。 • 选来源广、容易得到的原料。 • 用重组DNA技术（recombinant DNA technique） 获得大量稀有蛋白质。