宁德市医院病理科•Department of Pathology, Ningde City Hospital Affiliated to Fujian Medical University病理检验技术第十一章免疫组织化学技术和应用第一节免疫组织化学基本理论一、抗原（一）抗原的概念1.抗原（antigen，Ag）•指能刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与相应的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合，发生免疫效应的物质。

•其基本性能：（1）免疫原性（2）抗原性（免疫反应性）表位或抗原决定基（簇）•抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。

（二）抗原的基本性质1.异物性（1）抗原与自身成分相异。

（2）自身物质：隐蔽或修饰的。

•异物：凡是胚胎时期未与免疫系统中免疫活性细胞充分接触过的物质。

Ag所属物种与宿主之间的亲缘关系越远异物性越强2.特异性•由抗原决定簇的性质、数量和构型决定。

3.理化性质•分子量大小•化学组成•物理状态•分子结构和易接近性表位或抗原决定基（簇）•抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。

（三）抗原的分类1.根据其基本性能分为（1）完全抗原：免疫原性+免疫反应性：细菌、病毒等（2）半抗原：只有反应性，+载体=完全抗原2.根据其化学组成分为•蛋白质、多糖、核酸抗原。

3.根据其刺激机体时是否需Th辅助分为（1）TD-Ag（2）TI-Ag4.根据其与机体的亲缘关系分为（1）异种抗原（xenoantigen）（2）同种异型抗原（alloantigen）（3）自身抗原（autoantigen）•隔离部位：脑组织、晶状体、精子等。

•改变或修饰的：感染、外伤、药物。

（4）异嗜性抗原（heterophile antigen）二、抗体（一）抗体的概念1.抗体（antibody，Ab）•是指机体受抗原刺激产生的并能与相应抗原特异性结合的球蛋白。

因它是免疫应答的产物，故又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。

2.分区（1）可变区（variable region，VR）（包含高变区）（2）恒定区（constant region，CR）（3）铰链区（hinge region）免疫球蛋白的分区（二）抗体的功能1.抗体的功能（1）特异性结合抗原（2）激活补体（3）结合某些细胞（4）通过胎盘和黏膜（三）人工制备的抗体1.多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）2.单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）•是由识别一种抗原决定簇的B淋巴细胞克隆所产生的均一性抗体。

McAb多采用B淋巴细胞杂交瘤技术生产。

•McAb具有性质纯、效价高、特异性强、少或无交叉反应等特点，广泛用于冰冻切片和石蜡切片。

3.基因工程抗体（genetic engineering antibody，GeAb）•人源化，降低了鼠源性McAb的免疫原性，均一性强。

三、抗原抗体反应（一）概念和反应原理1.抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）•是指抗原与抗体之间发生的特异性结合反应。

（1）体内表现为：吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素作用。

（2）体外可出现：凝集、沉淀、补体结合、中和等反应。

2.反应原理•抗原的决定簇与抗体的抗原结合部位之间具有结构互补性。

在适宜条件下，两者可特异性结合、出现肉眼可见的反应，或借助仪器能检测到反应结果。

•据此对待检品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位的检测。

（二）反应特点1.高度特异性2.可逆性表面结合3.适当的浓度和比例4.反应的两个阶段性（1）第一阶段是抗原抗体的特异性结合阶段。

（2）第二阶段是可见反应阶段：凝集、沉淀等。

（三）抗原或抗体的检测方法1.凝集反应2.沉淀反应3.免疫标记技术（1）免疫荧光技术（2）免疫酶标技术（3）放射性核素技术（4）胶体金技术……•凝集反应：颗粒性抗原与抗体结合，在电解质存在下出现肉眼可见的凝集现象。

•直接凝集试验（三）切片•切片应薄而平整，一般厚度在3~5μm之间。

1.石蜡切片•与常规切片制备基本相同，应注意：（1）脱水、透明应在4℃以下进行，以减少抗原损失；（2）切片刀要锋利，切片应薄，可减少非特异性染色；（3）切片应放入37℃恒温箱过夜，以减少脱片；（4）如需长期保存，切片可放4℃冰箱内。

三、免疫组织化学常用液体及抗体的配制（一）常用液体的配制•0.01mol／L pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）•0.5mol／L pH7.6 Tris-HCl缓冲液•0.05mol/L pH7.6 Tris-HCl缓冲液（TBS）（二）抗体的稀释和保存1.影响抗体稀释度的因素2.抗体最佳稀释度的测定方法（1）直接测定法（2）棋盘（方阵）测定法（三）显色剂的种类及配制1. 3,3’-二氨基联苯胺（3,3’-Diaminobenzidine，DAB）2. 3-氨基-9-乙基卡巴唑（3-amino-9-ethlylcarbazde，AEC）3. 4-氯-1-萘酚（四）背景复染及复染剂1.背景复染2.复染剂（1）苏木素—石蜡切片（3）核固红—免疫金染色（2）甲基绿—冰冻切片五、抗原的修复（一）抗原修复的原因•抗原修复或暴露。

（二）常用的抗原修复方法1.酶消化法•胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素消化法。

2.物理化学法•单纯加热法、高压加热法、微波加热法。

第三节免疫组织化学的常用染色方法一、免疫组织化学常用染色方法•免疫组织化学的染色方法根据标记物的不同可分为三大类，即免疫荧光法、免疫酶标法、免疫胶体金银法。

每一类染色方法的基本原理相似，只是所用的标记物不同而已。

每一类染色均可分为直接法和间接法等。

•直接法操作步骤简单易行，但一种酶标抗体或金标抗体只能检测一种抗原，如需检测许多种抗原时，则每一种特异性抗体均需要进行酶标或金标，这是一项巨大而且繁琐的工作，且一旦特异性抗体进行酶标或金标后，其稳定性将有所降低，其效价也会随之降低，也不利于特异性抗体的保存，故直接法的应用受到限制。

•间接法只需标记一种抗体（即第二抗体），就可以检测许多种抗原成分，故间接法在临床上应用较广泛。

•免疫荧光法在诊断肾脏、皮肤的免疫性疾病上具有重要的价值。

但也存在着不足之处：①如需用新鲜冷冻组织进行检测，且敏感性和特异性较差；②所需特异性抗体用量较大；③背景着色不够清晰，常给确诊带来一定的困难；④因荧光强度随时间的延长逐渐减弱，故切片无法长期保存；⑤观察结果所用的荧光显微镜价格也比较昂贵等。

因此，使免疫荧光技术的推广和应用受到了很大的限制。

目前，逐渐被迅速发展起来的免疫酶标技术和免疫胶体金技术所代替。

二步法间接酶标法（1）染色原理•先用未标记的特异性抗体（一抗）与组织中的相应抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用酶标记的抗特异性抗体的抗体（二抗）与特异性抗体结合，形成抗原-特异性抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色，以显示抗原所在部位。

（2）染色方法1）常规石蜡切片经脱蜡、逐级乙醇到水。

2）PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。

3）用3%的过氧化氢甲醇液处理组织切片，室温下，湿盒内孵育10~30分钟。

4）PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。

5）需要进行抗原修复的，可根据需要采用酶消化法或物理化学法对抗原进行修复，修复完毕后，PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。

不需要进行抗原修复的组织切片，可直接进入下一步。

6）滴加适当稀释的动物非免疫血清，室温下，湿盒内作用10~20分钟，倾去多余的血清液体，擦干组织块周围多余的液体，不必冲洗。

7）滴加适当稀释的特异性抗体于组织切片上，放于湿盒内，4℃冰箱过夜或37℃温箱或室温下孵育30~60分钟。

8）PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。

9）滴加适当稀释的酶标记的抗体于组织切片上，放于湿盒内，37℃温箱孵育30分钟。

10）PBS冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。

11）滴加新配制的DAB显色剂，室温下3~5分钟，显微镜下观察，当出现阳性结果，而背景清晰时，即可终止显色。

12）自来水冲洗，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（3）染色结果•阳性部位呈现棕黄色-棕褐色颗粒。

ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶连接法）（1）染色原理•ABC法是利用卵白素与生物素之间具有高度亲和力这一生物学特性。

先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化的HRP，再与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素化的辣根过氧化物酶复合物，即ABC复合物。

先用生物素化的第二抗体与特异性一抗结合，再与ABC复合物连接，形成抗原-特异性一抗-生物素化二抗-ABC复合物。

最后用底物显色剂显色，以显示抗原所在部位。

SP三步法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）（1）染色原理•SP法的染色原理与ABC法相同。

只是用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素，即先将生物素化的辣根过氧化物酶与链霉菌抗生物素蛋白混合，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，即SP复合物。

再用生物素化的二抗，将特异性的一抗和SP复合物连接起来，形成抗原-特异性一抗-生物素化二抗-SP复合物。

最后用底物显色剂显色，以显示抗原的分布及含量。

二、免疫组织化学染色过程中的注意事项（一）正确设置阳性、阴性对照•在免疫组织化学染色过程中，有很多因素可影响到染色结果。

因此，对免疫组织化学染色结果的正确评价必须要有必要的对照，否则就不能作出正确的判断。

免疫组织化学染色常用的对照有阳性对照、阴性对照（空白对照、替代对照）、吸收试验、抑制试验和自身对照等。

其中在临床病理诊断工作中，应用最多、最普遍的是阳性对照和阴性对照。

1.阳性对照•是指用已经被证实了含有靶抗原的组织切片与待检组织切片一起做免疫组织化学染色，结果为阳性，称为阳性对照。

每一次染色都应设置阳性对照。

设置阳性对照的方法：可以使用自己平日工作中收集的阳性切片，也可以使用购买的同一厂家、同一批号抗体染色的阳性切片。

正确设置阳性对照的意义•是通过阳性对照证实：①靶抗原的存在并具有一定的活性；②染色步骤正确；③染色方法可靠；④各种试剂及抗体的浓度符合标准。

尤其是当阳性对照切片呈现阳性反应，而待检切片呈现阴性染色时，则可排除待检切片假阴性的可能。

•如阳性对照切片呈现阴性反应时，可能与阳性对照设置不正确（不含靶抗原），或抗原已被破坏，或抗体效价降低、失活，或染色方法及染色步骤有误等因素有关，说明本次染色无效。

2.阴性对照•是指用已知不含靶抗原的组织切片与待检组织切片一起做免疫组织化学染色，结果为阴性，称为阴性对照。