提高浓度可增加抗原与抗体分子碰撞机会， 加速抗原-抗体复合物的形成。
通常抗原-抗体反应的最适温度是37℃。
3.酸碱度
抗原-抗体反应的最适pH值在6-8之间。
pH过高或过低，均可影响抗原或抗体的理化性 状，影响试验的可靠性。
三、抗原-抗体反应类型和检测方法
根据抗原的性质、参与反应的成分和反应呈现的结果， 将抗原-抗体反应分为四类：
（二）B细胞增殖试验
2、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）： 方法与原理 用已知抗原包被固相载体（硝酸纤维素膜/PVDF膜），加入相应抗 原致敏的B细胞（抗体形成细胞）共同孵育后，当抗原致敏的B细胞通过 膜表面抗原识别受体（mIgM）接受固相表面相应抗原刺激后，可分泌 抗体并与固相表面相应抗原特异性结合；去除细胞和未结合的抗体，加 入酶标记第二抗体，通过底物显色，可在分泌抗体的B细胞所在处呈现 有色斑点。
2、间接凝集反应（indirect agglutination） 概念：将已知可溶性抗原或抗体与免疫无关的载体颗粒结合形成致敏颗 粒后，再与相应抗体或抗原进行反应出现的凝集现象。
应用
抗链“O”试验（ASO）——风湿病 类风湿因子测定（RF试验）——类风湿性关节炎（RA）
速率散射比浊/免疫比浊

单向琼脂扩散 2、沉淀反应 琼脂扩散
酶免疫测定法：ELISA 免疫测定技术 放射免疫测定法 化学发光免疫分析 酶免疫组化技术 3、免疫标记技术 免疫组化技术 免疫荧光技术 免疫胶体金技术 免疫电镜技术 免疫印迹技术 — Western blotting法 免疫层析技术 — 金标免疫层析法
第三节 免疫细胞的检测
一、免疫细胞的分离 （一）外周血单个核细胞的分离 （二）淋巴细胞及其亚群的分离 1.玻璃粘附分离法 2.尼龙毛分离法 3.E花结分离法 4.免疫吸附分离法（洗淘法）
（二）B细胞增殖试验 1、抗体形成细胞测定试验： 又称溶血空斑形成细胞试验（plaque forming cell assay，PFC） 或溶血空斑试验（hemolytic plaque assay） 可用来检测产生抗体的B细胞数量。
方法 ①将绵羊红细胞免疫4天后的小鼠脾细胞（内含绵羊红细胞致敏的B细胞— —抗体形成细胞）与绵羊红细胞在凝胶介质中混匀； ②倾注于平皿板进行孵育，使抗体形成细胞（antibody forming cell，AFC） 周围的绵羊红细胞被AFC产生的抗体致敏； ③在平皿板表面加豚鼠新鲜补体进行二次孵育，致敏绵羊红细胞激活补体 而发生溶解，在AFC周围出现肉眼可见的溶血空斑。 一个溶血空斑代表一个抗体形成细胞（浆细胞），通过计算溶血空斑数目 即可得知B细胞增殖分化和产生抗体的能力。 溶血空斑试验可分为直接法和间接法。上法为直接溶血空斑试验法，可用 来检测分泌IgM的抗体形成细胞。检测分泌IgG或其它类别Ig的抗体形成细胞须 用间接法。 间接法前两步与直接法相同，第三步需先加入抗IgG或其他类别Ig的抗体 （抗-抗体）后，再加豚鼠新鲜补体进行观察。
计数公式： 试验孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值 细胞毒活性（%）= 最大释放对照孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值 ×100%
（三）细胞毒试验
2、乳酸脱氢酶释放法：
方法与原理 将效应细胞与靶细胞按一定比例混合孵育，若靶细胞被杀伤，则存 在于胞内的乳酸脱氢酶（LDH）释放。用光度计测定培养上清液中乳酸 脱氢酶活性（通过加入LDH底物显色），根据计算公式可获得效应细胞 的杀伤活性。
特点：所需时间较长，从数分钟、数小时到 数日不等，且受电解质、温度和酸碱度等因 素影响。
二、抗原-抗体反应的影响因素 1.电解质：
在电解质作用下，抗原-抗体复合物失 去较多负电荷，使彼此连接出现肉眼可见的 凝集或沉淀现象。 试验中常用0.85%的NaCl溶液作为 稀释液，提供适当浓度的电解质。
2.温度
（一）T细胞增殖试验
常用检测方法： 1、3H-TdR掺入法： 取外周血单个核细胞（PBMC）与PHA共同培养，在终止培养 前8-15小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ）。 在细胞增殖过程中， 3H-TdR可掺入细胞新合成的DNA中，掺 入量与细胞增殖水平成正比。 培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活性， 可反映细胞的增殖状况。 该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，且易发生放射性 污染。
3、适宜的抗原抗体浓度和比例 在一定浓度范围内，二者比例合适，可出 现肉眼可见的反应物；
若比例不合适，即抗原或抗体过剩时，可 形成小分子抗原-抗体复合物。此种小分子复 合物多呈游离状态，不能为肉眼所见。
4、抗原-抗体反应的两个阶段
① 抗原-抗体特异性结合阶段： 特点：反应快，数秒钟至几分钟内完成。 ② 反应可见阶段：
（一）T细胞增殖试验
常用检测方法： 2、MTT法： MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5二苯基溴化四唑。 取外周血单个核细胞与PHA共同培养，在培养终止前数小时 加入MTT。 在细胞增殖过程中，MTT可掺入 细胞，并作为胞内线粒体琥 珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成褐色甲臜颗粒。 甲臜生成量与细胞增殖水平成正比，当甲臜被盐酸异丙醇或 二甲基亚砜溶解后，借助酶标测定仪检测细胞培养物OD值，即可 反映细胞的增殖水平。 该法灵敏度不如3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。
二、淋巴细胞及其亚群的分离 1、免疫吸附分离法（洗淘法）： 将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋 巴细胞悬液，使表达相应表面标志的淋巴细胞结合在培养板上，洗脱 后即可获得具有相应表面标志的淋巴细胞。 例 用抗CD4抗体包被聚苯乙烯培养板，可将CD4+T细胞与 CD8+T细胞相分离。 2、免疫磁珠（immune magnetic bead，IMB）分离法： 免疫磁珠由抗淋巴细胞表面标志的抗体与磁性微珠交联结合组成。 将免疫磁珠加入细胞悬液中后，可使表达相应表面标志的淋巴细 胞与之结合。然后，在磁场作用下，结合相应淋巴细胞的免疫磁珠吸 附在靠近磁铁的管壁上。弃去悬液中游离的细胞，将免疫磁珠结合的 细胞分离，即可获得具有某种表面标志的淋巴细胞。 该法所获细胞纯度高（93%-99%），活细胞率＞95%，比流式细 胞术省时、费用低，操作简单。
2.表面化学基团之间的可逆结合
3.适宜的抗原抗体浓度和比例 4.抗原抗体反应的两个阶段： 1）抗原抗体特异性结合阶段 2）可见反应阶段
一、抗原-抗体反应的特点
1、高度特异性： 抗原表位与抗体分子CDR的互补结合是抗原-抗 体反应的化学本质。
2、表面化学基团的可逆性
抗原与相应抗体除空间构型具有互补性外， 两者主要是通过分子表面的氢键、疏水键、静 电和范德华力非共价结合。 亲合力（avidity）: 指抗体分子的抗原结合部位与抗原表位之间 的结合强度
二、 免疫细胞功能测定
一、淋巴细胞功能测定
（一）T细胞增殖试验 1、特异性T细胞增殖试验： 2、非特异性T细胞增殖试验： 1、抗体形成细胞测定试验（溶血空斑试验）： 2、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）： 1、51Cr释放法 （三）细胞毒试验 2、乳酸脱氢酶释放法 形态学检测法 琼脂糖电泳法 3、凋亡细胞检测法 TUNEL法 流式细胞术检测法 二、吞噬细胞功能测定 （一）中性粒细胞趋化功能的测定 （二）中性粒细胞吞噬功能测定 （三）巨噬细胞吞噬功能测定
双向琼脂扩散
对流免疫电泳 免疫电泳技术 火箭免疫电泳 免疫电泳
（1）单向琼脂扩散试验（single agar diffusion） 特点：定量试验；敏感性较高。 应用： 测定血清中IgG、IgM、IgA等含 量和C3、C4等补体含量
单项琼脂扩散试验：
定量测定血清中IgG、M、A和单一补体含量 方法与原理
3、流式细胞术（flow cytometry）分离法：
是借助荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）将荧光 抗体标记的细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。
荧光激活细胞分类仪（简称流式细胞仪）集光学、流体力学、电力学和 计算机技术于一体，可对细胞作多参数定量测定和综合分析。 程序原理 将待测细胞悬液与荧光素标记的抗体反应后，在压力作用下（细胞）排成 单列经喷嘴喷出形成液滴射流（每个液滴包裹一个细胞）；在液滴射流与高速 聚焦激光束相交处，液滴中细胞受激发光照射可产生散射光并激发各种荧光信 号；荧光信号被光电检测器接受可转化为电信号；电信号经加工处理存储于计 算机中，再用分析软件对数据进行统计处理和图像显示，快速准确获得结果。 流式细胞仪的主要用途 ①定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子； ②免疫细胞分类和百分计数； ③白血病和淋巴瘤的免疫学分型； ④细胞周期和细胞凋亡检测。 此外，流式细胞仪还具有分选功能，借助光电效应、微滴通过电场时出现 不同偏向，可分类收集所需的细胞及其亚群。分选纯度高达95%以上，且可保 持细胞活性，可进一步研究使用。
5.免疫磁珠分离法（IMB法）
6.流式细胞术分离法
一、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）包括淋巴细胞和单核 细胞，它们是免疫学实验中最常用的细胞。
常用的分离方法： 葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密 度梯度离心法。
2、双向琼脂扩散试验（double agar diffusion ）
应用（1）定性试验：①鉴定可溶性抗原和抗体。
②分析复杂抗原成分和抗体
（2）半定量试验：免疫血清稀释后进行的血清 效价测定。
4火箭电泳（rocket electrophoresis）
又称电泳免疫扩散
优点：敏感性同单扩散；所需时间短。 应用：快速测定标本中可溶性抗原的含量。
1、直接凝集反应（direct agglutination） 概念：颗粒性抗原直接与相应抗体结合出现的凝集现象。 检测方法： （1）玻片法： 特点 定性试验； 用已知抗体检测未知抗原； 本法简捷快速；