BAS-ELISA:可用来检测细菌、病毒、肿 瘤细胞表面抗原等。 生物素与抗生物素 有极高的亲和力，利用抗生物素为桥梁 ，联结生物素化的抗体及生物素化过氧 化物酶，可获得极高的敏感性（多级放 大系统）。
■-Ab+待测Ag+ Ab-生物素化+抗生物素（四价）+ 生物素化—E+底物
• 生物素(biotin，B)
★单向免疫扩散的应用 应用：测定血清中IgG、IgM、IgA 与补体C3的含量. 缺点:1～2天才出结果。
★双向免疫扩散的应用 应用：根据沉淀线的数目和形状可
对抗原或抗体进行定性检测、组分
分析等。
单向琼脂扩散试验
双向琼脂扩散试验
★对流免疫电泳可检测： 血液中的HBsAg和AFP
★免疫比浊法主要用于： 血清蛋白及抗体成分的分析研究
抗原或抗体的检测
双抗体夹心法: 常用于检测标本中的抗原。将已
知抗体包被在固相载体上，加入待测 标本，使其中的抗原与抗体结合，洗 去未结合的抗原，加入已知的酶标抗 体与标本中抗原结合，再洗去未结合 的酶标抗体，加入底物，底物受酶的 催化发生化学反应产生有色物质。
待测 抗原
酶标 抗体
抗体
底物
双抗体夹心法
抗原或抗体的检测
间接法: 常用于检测血清中的抗体。将已知抗
原包被于固相载体，加入待检标本，若标 本中有相应的抗体，则可与抗原结合，再 加入酶标二抗，洗涤后加底物，底物受酶 的催化发生化学反应产生有色物质。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
已知 待测 抗原 抗体
酶标 抗体
• 此法是测定抗体最常用的方法。
间接法
酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)
Ab 过剩
Ag 过剩
比例适当，交联成网络
（二）抗原抗体反应的影响因素 1.电解质 抗原抗体（等电点pH3-5和pH5-6）在 中性或弱碱性条件下带有负电荷，需适当 浓度的电解质（如0.85%NaCl）才会结合； 2.温度 通常为37℃ 3.酸碱度 最适pH值在6-8之间。pH值接 近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等， 由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性 反应。
生物素在机体内以辅酶形式参与各 种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生 素H。分子中有两个环状结构，其中I环 为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部 位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链， 其末端羧基是结合抗体和其他生物大分 子的唯一结构。
• 亲和素 (avidin，A) 与生物素结合后稳定，亲合素由4
个相同的亚基组成，能结合4个分子的 生物素。亲合素与生物素之间的亲和力 极强，二者能快速结合，且反应不受外 界干扰，具有高度特异性和稳定性。
（二）抗体的钝化与分离
1.非特异性免疫球蛋白的分离钝化 2.抗原特异性免疫球蛋白的分离钝化。
二、抗原抗体反应的检测方法
抗原抗体反应
凝集反应
沉淀反应
蛋白芯片 技术
免疫标记
直接凝集 间接凝集
免疫比浊 单向免疫扩散
双向免疫扩散
免疫电泳
荧光 酶 同位素 化学发光 胶体金 免疫印迹
1.凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应
1:8
1:16
直接Coombs试验
抗人免疫球蛋白 待测标本
作用:对新生儿Rh+血型是否发生溶血现 象的进行诊断
⑵ 间接凝集反应的应用
常用的载体颗粒：人O型血红细胞 和 聚苯乙烯乳胶颗粒
应用：链球菌O抗体的检测实验; 类风湿因子的检测. Coombs试验
间接Coombs试验
已知的Rh+ 红细胞
经产妇的待 测血清标本
免疫电泳 (immunoelectrophoresis)
对流免疫电泳
火箭电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关。
测吸光度
抗原或抗体的检测
3.免疫标记技术 用荧光素、酶、同位素等标记抗
体或抗原用以测定相应抗原或抗体的 技术称为免疫标记技术。 特点：敏感、特异、快速，能定性、 定量、定位。
BAS-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗 体以及DNA、RNA的检测。
卵白及某些微生物中的蛋白质
抗原或抗体的检测 酶免疫斑点试验
斑点金免疫层析试验
胶体金：氯金酸（HAuCl4）在还原剂的 作用下，可聚合成特定大小的金颗粒， 因其在静电作用下而呈稳定的胶体状态 ，故称胶体金。
免疫标记技术常用方法
★免疫荧光技术 ★酶免疫测定法EIA ★放射免疫测定法 ★化学发光免疫技术 ★免疫胶体金技术 ★免疫印迹法
(1)免疫荧光技术 是用荧光素标记一抗或二抗，检
测特异性抗原或抗体的方法。常用的 荧光素有异硫氰酸荧光素、藻红蛋白 等.
直接荧光法：检测不同的抗原，需要不 同的特异性荧光抗体
间接荧光法：用一抗与样本中的抗原结 合，再用荧光素标记的二抗染色。此方 法既可检测抗原又可检测抗体。若查抗 原，一抗为已知的；若查抗体，抗原是 已知的。一种荧光抗体可用于多种不同 抗原的检测
免疫荧光技术
(2)酶免疫测定法（EIA） ： 1971年瑞典学者Engvail和Perlman-
nn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别 报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，称为酶联免 疫吸附试验（ELISA）。
免疫学实验技术 及其应用
免疫学诊断
●抗原或抗体的检测 ●免疫细胞及其功能有关测定 ●免疫功能检测的临床应用
第一节 抗原或抗体的检测
一、抗原抗体结合反应的特点及影响因素
(一)抗原抗体反应的特点 1.特异性 2.亲和力 3.可逆性 4.可见性 5.阶段性： 特异性结合阶段、肉眼可见阶段
Ag-Ab反应的可见性
抗人免疫球蛋白
作用:此实验阳性的经产妇经最近不能 再次妊娠
（3） 间接凝集抑制试验
检测标本中是否存在与致敏载体 相同的抗原。
凝集反应原理图解（一）
凝集反应原理图解（二）
凝集反应原理图解（三）
抗原或抗体的检测
2.沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合后出现
沉淀物称沉淀反应。
★单向免疫扩散
★双向免疫扩散 ★免疫电泳 ★免疫比浊法
抗体结合后形成凝集团块称凝集反应。
★直接凝集反应
★间接凝集反应
⑴直接凝集反应的作法及应用
玻片法：定性试验,主要用于细 菌与人类ABO血型的鉴定。
试管法：半定量试验.常用于检测抗 体的滴度或效价，临床诊断伤寒或 副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布 氏菌病所用的瑞特试验
玻片法
直 接
凝 试管法
集 反 应
1:2稀释待测血清 1:4