中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2008, 28 (1) : 80～86
综 述
H IV21整合酶及其抑制剂的研究进展 3
李芳琼 丁 倩 詹金彪 33
(浙江大学生化与遗传学系 杭州 310058)
摘要 H IV 21整合酶是由 H IV 病毒 pol基因编码的分子量为 32kDa的蛋白质 ,是 H IV 病毒复制的 必需酶之一 ,它催化病毒 DNA 整合入宿主染色体 DNA。人类细胞中没有 H IV 整合酶的类似物 , 理论上抑制整合酶对人体副作用很小 。因此 H IV 21整合酶成为继 H IV 21蛋白酶 ,逆转录酶后治疗 艾滋病的富有吸引力和合理的靶标 。综述了 H IV 整合酶结构 ,抑制剂的研究以及以 H IV 21 整和 酶为靶点治疗 A IDS方法的最新研究进展 。 关键词 人类免疫缺陷 I型病毒 整合酶 抑制剂 RNA 干扰 中图分类号 Q789
1981 年美国 Gottlieb等 [1 ]在临床诊断中发现了免 疫 缺 陷 症 状 的 艾 滋 病 ( Acquired immunodeficiency syndrome, A IDS ) ; 1983 年 证 实 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 ( Human immunodeficiency virus, H IV ) 是其病原体 [2 ] 。 至今 , A IDS已经成为人类最主要的流行病之一 ,全球有 超过 4000多万 H IV 感染者 , A IDS的治疗是国际医学 界面临的一个巨大挑战 。虽然从 H IV 被正式确认为 A IDS的病原体到第一个有效抗病毒药物 AZT应用于 临床 ,科学家只用了不到六年的时间 ,但是 ,时至今日 , A IDS仍然没有得到有效的控制 [3 ] 。高效抗病毒疗法 ( HAART)是 FDA 推荐的治疗 A IDS的标准方案 [4 ] ,虽 然 HARRT能将 H IV RNA 滴度控制在监测水平以下 , 但它不能将病毒从血液单核细胞和 T淋巴细胞中清 除 , 还会导 致 多 重 耐 药 和 很 多 的 并 发 症 , 且 费 用 昂 贵 [5 ] 。因此寻找其它的抗病毒靶点 ,对开辟新的治疗 A IDS的有效途径非常重要 。1985年 Lee Ratner测定了 艾滋病毒全基因组序列 ,发现 pol基因阅读框 3′端和其 他逆转录病毒一样编码一个核酸内切酶 ,即整合酶 [6 ] 。 随着研究深入 ,发现人类细胞中没有 H IV 整合酶的类 似物 [7 ] ; H IV 21 整合酶因为其在 H IV 生命周期中所扮
图 2 H IV21整合酶四聚体的构建过程 F ig. 2 Schema tic represen ta tion of the
m odel bu ild ing process ( a) Structure of the combined core and C2term inal domain dimer ( PDB code 1EX4) ( b ) Structure of the N 2term inal domain dimer ( PDB code 1WJA ) ( c) Structural model of full2length integrase dimer ( d) full2length integrase dimer bound w ith viral DNA U5 LTR ( e) Full2length integrase tetramer bound with viral DNA U3 and U5
图 1 H IV Pol多肽前体结构和整合酶的结构域 F ig. 1 The H IV Pol polyprote in structure and in度保守的 DD ( 35) E模序 ,这个模序在逆转录病毒整合 酶中普遍存在 , 在 H IV 21 整合酶中该模序由 ASP264、 ASP2116和 GLU 2152 组成 ,其中的两个 ASP 与一个两 价金属离子 (M g2 + /M n2 + )结合形成一个复合体 。作为 辅助因子 ,两价金属离子对整合酶的催化作用是不可 或缺的 。目前为止 ,虽然没有确定具体是哪一种二价 金属离子与 ASP结合 ,但是一般认为 mg2 +比其他二价 离子更有可能成为这个辅助因子 [10 ] 。此外 ,虽然 x2ray 衍射结构显示只有一个离子在活性中心 ,但是 DD ( 35 ) E基序的第三个氨基酸 GLU 2152 会与另一个金属离子 结合以完成整合过程 ,这个金属离子的结合仅仅在整 合酶与 DNA 底物结合时发生 [11 ] 。体外试验中 ,整合酶 发挥整合催化作用时必须 3 个结构域同时存在 ,但是 单独的 核 心 区 域 具 有 去 整 合 的 活 性 (整 合 的 逆 过 程 ) [ 12 ] 。 1. 1. 3 C2末 端 结 构 域 ( CTD ) 是 H IV 21 整 合 酶 与 DNA 底物的结合平台 ,氨基酸残基序列为 212～288,主 要由 β链构成 ,有一个完整的 SH3 ( Src Homom logy 3 ) 折叠 ,是逆转录病毒整合酶中最不保守的结构域 ,它与 DNA 非特异性的结合 ,参与整合过程的 3′端加工和链 转移 ,有稳定 IN 2DNA 复合物的作用 。此外 ,它还和蛋 白 2蛋白间相互作用有关 ,已经证实它和逆转录酶的相 互作用对逆转录酶的催化活性很重要 [13 ] 。 一般认为 ,整合酶是以多聚体的形式发挥整合作 用的 ,活性的 H IV 21 整合酶至少要以四聚体形式才能 发挥其加工病毒 DNA LTR ,并将其整合入宿主 DNA 的 作用 [14 ] 。整合酶的 3个结构域单独的晶体结构以及核 心区域与 N 末端 /C末端一起的 NMR 晶体结构都已构 建出来 ,但是因为整合酶可溶性很低 ,在测定条件下易 发生多聚反应 ,从而限制了其整个空间结构的测定 ,故 3个结构域的空间排布以及与 DNA 底物形成的活性复
2 以 H IV21 整合酶为靶标的抗 H IV 研究 进展
至今为止 ,美国食品与药品管理局 ( FDA )批准的 抗 H IV 药物中 , 没有一种是针对整合酶这一靶点的 。 与 H IV 蛋白酶和逆转录酶不同 , H IV 21 整合酶在细胞 内没有类似物 ,因此以 H IV 整合酶为靶标进行抗病毒 治疗有很大的优势 。因为整合酶的整体晶体结构还没 有构建出来 , 基于整合酶结构的抑制剂设计比较难 。 尽管如此 ,近 10年来 ,以 H IV 21整合酶为靶标的抗 H IV 研究取得了很大的进展 。很多新的抑制剂不断被筛选 出来 。一些整合酶的抑制剂已经进入了临床试验 。此 外 ,利用 RNA i干扰技术对 H IV 整合酶 ,以及 P IC 的辅 助因子进行基因沉默 ,也可以达到抗病毒的目的 。以 下将予以分述之 。 2. 1 几类主要 H IV21整合酶抑制剂研究进展 自 1993第一个 H IV 21 整合酶抑制剂被发现 ,许多 天然的 /合成的物质在以模拟病毒 cDNA LTR 为底物 , 重组整合酶的活性分析中显示出抑制整合酶的活性 。 根据整合酶抑制剂化学性质和来源可将其主要分为 : 二酮酸类抑制剂 ,肽类抑制剂 , 核苷类抑制剂 ,天然来 源抑制剂 ,多羟基化的芳香族化合物 [10 ] 。要判断一种 物质在细胞内是否以 H IV 21 整合酶为靶标 ,必须满足 : (1)抑制反应必须发生在逆转录和整合酶成熟后 ,即 H IV 21 感染 4～16小时后 。 ( 2)加入抑制剂后感染细胞 内整合反应减少 ,有病毒 LTR 的聚集 。 ( 3)抗药株细胞 内有整合酶突变体的聚集 。 ( 4 )在之前检测到整合酶 突变体的细胞株 ,该抑制剂对整合酶不再有抑制作用 。
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 28 No. 1 2008
与 DNA 结合来调节整合酶的活性的 ,其病毒蛋白如逆 转录酶 ( RT) , matrix (M a) ,核蛋白体 (Nc) 和 Vp r能够 促进 P IC转运通过核膜 [4 ] 。 1. 2. 2 链转移 ( strand transfer)反应 P IC 入核后 ,整 合酶交错切割宿主细胞染色体 DNA , 产生间隔 5 个碱 基的交错切口 , 然后病毒 DNA 的 3′端带自由羟基的碱 基与宿主 DNA 的 5′端共价连接起来 , 此后由细胞的 DNA 修复酶将病毒 DNA 5′末端与宿主 DNA 3′末端补 齐 ,完成了整个整合过程 。研究发现 ,整合过程偏爱发 生在宿主 DNA 链有严重扭曲的位点 ,表明链转移反应 时需要宿主 DNA 提供一个相对宽大的凹槽 ,此外 ,宿 主细胞内活化的基因片段和基因组的热点区域都是整 合易发生的位点 [16 ] 。
收稿日期 : 2007210210 修回日期 : 2007210229 3 国家自然科学基金资助项目 (30670424) 33通讯作者 ,电子信箱 : j2kzhan@ zju. edu. cn
演的重要角色 ,毫无疑问会在抗病毒过程中发挥重要 作用 。近年来随着 H IV 21 整合酶 N 端区域 、核心区域 和 C 端区域的晶体结构相继被测定出来 ,针对其整合 酶的抗病毒研究成为了治疗 A IDS的热点 。
LTR s
1. 2 H IV21整合酶的功能 H IV 21 整合酶的功能是催化 H IV cDNA 整合进入 人体 基 因 组 , 主 要 通 过 3′加 工 和 链 转 移 ( strand transfer)反应两个步骤完成 。 1. 2. 1 3′端加工 H IV 21侵入 CD4 + T细胞后 ,病毒的 单链 RNA 在胞浆内逆转录成 cDNA , cDNA 末端包含 了一个保守的 CAGT序列 ,整合酶在胞质中特异识别 该序列 ,在两个 3′端通过一步水解磷酸二酯键反应分 别切下两个核苷酸 ( GT) , 露出高度保守的 3′2CA 末 端 ,这个过程被称为 3′端加工 ,该反应需要二价金属离 子 M g2 + /M n2 +作为亲核试剂参与 。之后 , 整合酶仍然 以多聚体的形式与加工过的 DNA 结合在一起 ,并与其 他一些细胞 、病毒的蛋白一起形成病毒 DNA 蛋白复合 物 ( p re2integration comp lex P IC ) 。最新 的一 些 研 究发 现 , P IC中的细胞蛋白 IN I1, LEDGF /p75, HSP60 直接与 整合酶结合 ,它们可以提高整合酶的活性 。此外 ,另外 两个细胞蛋白 high2mobility group p rotein A1 ( HMGA1) 和 barrier to auto2integration factor (BAF)也是通过直接