低氧诱导因子家族研究进展%李启芳综述 戴爱国审阅湖南省老年医院湖南省老年医学研究所呼吸疾病研究室(长沙9410001)摘要 低氧能诱导编码促红细胞生成素基因的转录9过程的具体分子机理一直不清o 低氧诱导因子家族的克隆及其调控许多目的基因表达的发现9丰富了我们对机体氧感受的分子机理的认识o 同时低氧诱导因子家族中各因子的表达差异9及其之间的相互调控9低氧诱导因子在低氧条件下的作用机理9对目的基因的调控及相互之间差异的阐明9对理解许多与组织缺氧有关的重要疾病如心血管疾病\中风\慢性阻塞性肺疾病9特别是肿瘤的病理生理过程有重要意义o关键词 低氧诱导因子; 基因表达调控; 脯氨酸化酶%国家自然科学基金资助项目(NO ~30270581)哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反映的转录因子9能激活许多低氧反应性基因的表达9是在低氧条件下维持氧稳态的关键性物质9称低氧诱导因子o 自1992年发现低氧诱导因子1(h yp Oxi a i nduci bl e f act Or 19H I F -1)以来91997年和1998年又相继发现了H I F -2和H I F -3o 目前认为H I F 在体内可能存在一个家族(H I FS )o 现已知H I FS 家族成员H I F -1\H I F -2和H I F -3具有以下共同特点~ 均属于碱性多肽-螺旋-环-螺旋-(baSi c-heli x-l OO p -heli x 9b HL H )-PAS (p er-ARNT -AHR -S i m )超家族的O 和 亚基组成的不同亚基二聚体转录因子9O 亚基为低氧调控的主要功能亚基(H I F -1O 及H I F -2O 9H I F -3O )和对低氧不敏感的H I F -1 亚基; 缺氧均可诱导H I FS 转录\翻译及活性9其在体内介导生理或病理作用均依赖于通过与目的基因的缺氧应答元件(h yp Oxi a re-S p OnSe el e m entS 9HRE )结合而调节目的基因的表达来实现ol H IF S 的发现及C DNA 克隆低氧诱导因子-1是Se m enza 等[1]1992年发现的o 他等将人肝癌He p 3B 细胞用1 低氧处理9细胞内EPO mRNA 可增加50倍9而且缺氧处理过的细胞9其细胞核提取物也具有促进基因转录的作用9但预先给予蛋白质合成抑制剂能阻断缺氧对基因表达的诱导作用;在非EPO 表达的细胞里也有类似的结果o 以后又观察到该因子对多种低氧反应基因(h yp Oxi a reS p OnSi ve g eneS 9HRG )的转录都有调控作用9并可能参与对低氧反应的信号转导过程9遂命名为H I F -1o 随之9从He p 3B 细胞c DNA 文库中克隆了H I F -1O 和H I F -1 的全长c DNA 序列\其中人的H I F -1O c DNA 全长为3720b p 9开放阅读框2478b p 9编码826个氨基酸9应用体细胞杂交分析和荧光原位杂交方法证实人H I F -1O 的基因位于第14号染色体(14C 21-4)9小鼠的H I F1O 的c DNA 序列全长3746b p 9开放阅读框2430b p 9编码810个氨基酸9与人的H I F -1O c DNA 序列有90 的同源性9小鼠H I F -1O 基因位于第12号染色体o 人的H I F -1 c DNA 序列和已知的芳香烃受体核转运蛋白(ar y l h y dr Ocar bOn rece p t Or nucl ear tranSl Ocat er-Or 9ARNT )相同o 全长为2604b p 9开放阅读框2367b p 9编码789个氨基酸o 在其基因中有一段长度为45b p 的可变外显子9编码15个氨基酸9因此体内还存在一种774个氨基酸的H I F -1 9小鼠的H I F -1 基因定位于第3号染色体o 随后9Em a [2]与Gu [3]分别发现低氧诱导因子家族的另外两个成员H I F -2O 和H I F -3O 9结果表明~不同种系同一种H I F -O 亚基之间高度同源;但同一种系不同H I F -O 亚基之间同源性较低;而在3种H I F -亚基不同功能区之间其同源性却较高o 人H I F -3O 是位于19号染色体9其c DNA 长约2kb 9编码668个氨基酸的H I F -3O 多肽9在氨基端反式激活区域(N -t er m i-nal tranSacti vati On dO m ai n 9NAD )区域99与H I F -1O 9H I F -2O 之间一致性分别为58 和52 9但缺乏羧基端反式激活区域(C -t er m i nal tranSacti vati On dO m ai n 9CAD )9H I F -1O 和H I F -2O 均含有NAD 和CAD 两个反式激活区[4]o2H IF S的表达差异及相互调控除了广泛表达的H I F-1O外此家族中的另两成员H I F-2O和H I F-3O也被逐渐阐明但后两者仅在一定组织中表达体外比较H I F-1O和H I F-2 O发现两者在基因组成蛋白分子结构低氧状况下蛋白稳定性与ARNT形成异源二聚体及DNA 识别DNA结合报告基因的反式激活方面均有许多的相似性体内体外实验均发现3种亚基表达模式上部分重叠因此H I F-2O和H I F-3O可能与H I F-1O的目的基因的DNA结合位点相互作用5 K i etz m ann等6从初生的大鼠肝克隆3种H I F-O 亚基所有3种c DNA均编码功能活性蛋白且发现H I F-O亚基mRNA比较集中表达于大鼠肝脏组织的静脉血管周围区域但H I F-O蛋白表达则未出现这种明显分带现象YOShi da等7在自发性多囊肝肾SD大鼠<C r=CD>中检测VEGF H I F-1O H I F-3O表达时发现在多囊肝组织中肝细胞胞浆中VEGF强表达在肝细胞核中出现H I F-3O表达而无H I F-1O表达;在多囊肾组织中VEGF表达于集合小管和远曲小管细胞浆而H I F-1O和H I F-3O则分别表达于近曲小管和Henl e层细胞核内H I F-3O的羧基末端有一36氨基酸序列其与H I F-1O的低氧反应区域<h yp Oxi a reS p OnSi ve dO-m ai n-1HRD-1>有61的一致性T ranSi ent tranSf ecti On研究法发现当此区域与一异源性反式激位区域结合其介导低氧性反应体外试验表明H I F-3O与H I F-1二聚化进而能识别HRE的核心序列实验表明H I F-3O ARNT相互作用也可在体内发生且在氧化钴或低氧的刺激下的活性增加3通过H I F-2O基因敲除小鼠研究发现大部分纯合变异小鼠易出血且没有分明显的血管管腔结构小血管之间不能相互融合形成大的血管因此表明H I F-2O在血管形成中发挥重要的作用最近Hara等4发现缺氧转染H I FS的细胞H I F-1O和H I F-2O蛋白表达增高而H I F-3O无变化;报告基因分析法<re p Ort er g ene anal y Si S>发现转染H I F-1O和H I F-2O均可上调目标基因HRE的转录然而转染H I F-3O却抑制转录通过共转染方法用cOS-7细胞共转染H I F-3O表达载体和H I F-1O或H I F-2O载体发现H I F-3O转染既抑制H I F-1O又抑制H I F-2O所调节的基因表达即使H I F-3O羧基端<1386><缺失羧基端氨基酸387 667但有b HL H和PAS区域>删去后仍可抑制H I F-1O和H I F-2O对目标基因表达的上调作用提示H I F-3O可能是缺氧调控目标基因表达的负性调节因子同时说明H I F-1O H I F-2O H I F-3O调控目标基因表达存在明显区别和差异然而H I F 家族每一成员的具体作用需进一步的实验来证实3H IF S的作用机理H I FS转录因子包括两个亚单位即低氧调控的O亚单位<H I F-1O H I F-2O H I F-3O>和对氧不敏感的亚基也叫ARNT在常氧条件下H I F-1O 亚基虽然表达但很快降解因此没有H I F蛋白聚积低氧条件下O亚基的降解被阻断结果H I F-1 O在核内聚积并和亚基结合后能识别低氧反应目标基因启动子内的H I F反应元件<HRE>常氧条件下H I F-1O的降解发生在转录后水平即一段叫氧依赖性降解区域<Ox yg en de p endent de g ra-dati On dO m ai n ODD>的多肽序列内的保守性脯氨酸残基被羟化8羟化的脯氨酸残基被泛素连接酶复合体的组分VOn H i pp el-L i ndau肿瘤抑制蛋白<VOn H i pp el-L i ndau t u mOr Su pp reSSOr p r Ot ei np VHL>识别导致蛋白酶体对H I F-1O的识别和降解这一关键性调节是由铁依赖性脯氨酰羟化酶家族催化p VHL是泛素-蛋白连接酶的底物识别亚单位包括E l On g i n B E l On g i n C Cul2Rbx1<VBC-CR cO m p l ex>VBC-CR cO m p l ex与相关的泛素一蛋白连接酶Sk p1-cull-F-bOx家族催化泛素从泛素结合酶到底物的特异性赖氨酸残基9p VHL与H I F-1的结合依赖氧依赖降解区域<ODD>-核心脯氨酸残基<Pr O564>的羟化这一过程是被新发现的脯氨酸羟化酶在有氧条件下催化10氧依赖降解域一20个残基的降解序列对脯氨酸羟化酶羟化作用及与p VHL结合都是必须的p VHL包括两个紧密相伴的区域包含约100个氨基酸的域和约35个氨基酸的O区域O区域与E l On g i n C结合后者再与VBC复合体Cul2-RObx1一起形成泛素蛋白连接酶11H I F-1O仅仅与p VHL的区域相互作用形成5个主链酰氨基间的氢键与H I F-O 结合的p VHL区域侧面疏水核心部分暴露此暴露的区域和几个部分隐藏的极性残基形成了羟化脯氨酸的结合位点12细胞外蛋白的羟化脯氨酸起结构性作用而H I F-O的羟化脯氨酸则起了重要的信号作用H I F-1O VBC复合物结构表明其严格的特异性信号特点这一结构也为发现H I F降解的阻断剂和在心血管疾病中风等严重疾病中发现促进治疗性血管新生提供了一个框架脯氨酸羟化酶以分子氧为底物催化目标脯氨酸残基的羟化因为分子氧起了脯氨酸羟化酶活性的限速作用所以这些酶也许是真正连接浓度和低氧反应通路组分的氧敏感器H I F~p VHL相互作用依赖于H I F蛋白降解域内的脯氨酸残基的羟化而这一翻译后修饰在低氧条件下被抑制故H I F 蛋白水平在低氧条件得以稳定可能由于O2与需二价Fe和O2的H I F脯氨酸羟化酶结合的减少蛋白稳定性的调节仅仅是低氧诱导H I FS活性的一种方式除了ODD区域3种亚单位还包括两个对基因表达至关重要的结合共同活化因子的区域其中一个和ODD重叠对其调节可能是蛋白稳定性的次要部分13]第2个是羟基端反式转录活性区域C C-TAD>独立于ODD并能在低氧条件下结合共同活化因子复合物如P300/CBP C-TAD活性的调节也是氧依赖性对保守性天冬酰胺残基的羟化14]LandO等15]发现H I F的低氧性CAD诱导是通过对CAD内保守性天冬酰氨羟化过程抑制实现的特异性阻断天冬酰氨羟化可使CAD和共同转录活化因子P300作用以亮氨酸代替天冬氨酸则可使P300有强的转录活性因此H I F-1O H I F-2O的充分诱导依赖于对脯氨酸残基及天冬氨酸残基羟化的阻断M aki nO等16]发现一个新的H I F-O功能的主要负性调节子C i nhi bit Or y PAS dO-m ai n p r Ot ei n I PAS>I PAS和H I F-蛋白二聚化因而阻断H I F-与目标基因的低氧反应元件C HRE>的相互作用角膜I PAS的表达和H I F-目的基因产物VEGF在低氧条件下的低水平表达相关4H IF S对目的基因的调控H I FS是氧调节基因表达过程中一主要调节因子到现在为止已发现20多种目的基因且越来越多的直接或间接目的基因仍在不断的发现之中4.l铁代谢中的目的基因铁是血红素形成过程中必须的一种元素同时也是促红细胞生成素形成最常见的限制因子低氧可能通过增加铁转运到红系组织从而提高转铁蛋白的表达转铁蛋白受体是H I F-1的目的基因并导致细胞转铁蛋白的摄取同时血浆铜蓝蛋白也是H I F-1的目的基因作为铁氧化酶铜蓝蛋白是亚铁氧化成3价铁所必须的17]因为只有3价铁才能为铁蛋白所结合故低氧性铜蓝蛋白诱导就可能促进铁转运到红系组织4.2血管生物学中的目的基因系统在氧的严密调节之下血管生物学中VEGF是最主要的H I F-1目的基因H I F-1似乎调节VEGF的flt-1受体但也有持不同观点者新近报道一种内分泌腺源性VEGF可能为H I F-1目的基因血管生成的增加可致血管密度增加和氧弥散距离的下降但病理生理条件下局部血流是受血管舒缩状态的调控CO~NO~内皮素-1~肾上腺髓质素~肾上腺能O1B受体的激活均受H I F目的基因的调控进而调节血管舒缩状态角细胞特异性启动子调控下的H I F-1表达的转基因小鼠可产生血管过多~与此相反VEGF转基因小鼠则没有观察到血管的漏出和炎症反应因此H I F-介导血管生成的机制远不止仅仅通过诱导VEGF可能通过介导血管成熟的其它目的基因18]Hu等19]用低氧诱导大鼠的肺动脉高压检测其肺小动脉H I F-1O和i NOS蛋白和mRNA表达水平发现H I F-1O蛋白可上调i NOS基因表达且i NOS蛋白可反馈抑制H I F-1O蛋白的表达水平4.3糖代谢中的目的基因在氧供应减少的条件下无氧酵解就成为细胞产生的ATP主要形式现已证实许多与葡萄糖摄取及糖酵解的基因均为H I F-1目的基因无氧酵解增强可使乳糖产生增多p H值下降尽管有充足的葡萄糖供应也可能限制ATP的来源据报道转膜碳酸酐酶为H I F-1目的基因碳酸酐酶通过把二碳化合物和质子转化为CO2而调节p H值CO2被红细胞摄取而转运到肺肿瘤细胞结构性活化无氧代谢可解释氧不足时细胞的自主性反应因此在肿瘤低氧性适应过程中H I F的功能不仅是VEGF 介导的血管生成增加糖酵解P H缓冲等可能在肿瘤发生发展中还有其它关键性细节5H IF S在肿瘤生物学中的作用大量资料显示H I FS与肿瘤行为的许多重要方面均有关首先在实体瘤内很易观察到H I FS 的活化;其次细胞培养时由H I FS活性所诱导的基因种类与通常认为与肿瘤相关的基因种类一致;第三H I FS的失活对肿瘤模型的行为有重要作用20]研究表明:大量肿瘤抑制基因的失活C如p VHL~PTEN和p53>;多种肿瘤基因的激活C如Ha-raS~c-M y c>及不同生长因子通路的激活C如表皮生长因子~胰岛素~I GF-1~I GF-2~血管紧张素~血栓素~及PDGF>均可诱导H I F的活化基于H I FS在肿瘤组织中的表达上调及H I FS对血管生长因子有上调作用和血管生长因子在肿瘤中的作用可以推测H I FS通路阻断剂可降低血管生成和肿瘤生长且在小鼠的肝癌细胞和胚胎干细胞中得到证实但也有得出完全相反结论者看来H I FS 的激活在肿瘤生长中有许多相互矛盾的效应在不同的环境中发挥不同的作用参考文献1S e m enza G L et al.M Ol Cell B i Ol199212125447 2Em a M et al.Pr Oc Natl A cad S ci USA1997944273 3Gu Y Z et al.G ene Ex p1998732054Hara S et al B i O p h y ReS CO mmun20012874808 5ROland H W.FASEB200216811516K i etz m ann T et al.B i Oche m20013545317YOShi da T et al.Ex p T OxicOl Pat hOl2001532-31238R ichar d K et al.S ci ence20022958079B r uick R K et al.S ci ence2001294133710JaakkOl a P et al.S ci ence200129246811Yu F et al.Pr Oc Natl A cad S ci USA2001989630 12Jun g-h y un et al.S ci ence2002296188613E p Stei n A C et al.Cell20011074314Gu J et al.J B i Ol Che m2001276335015LandO D et al.S ci ence200229585816M aki nO Y et al.Nat ure200141455017M ukhO p adh y a y C K et al.J B i Ol Che m2000275 2104818E lSOn DA et al.G eneS D ev200115252019Hu RC et al.Chi n M ed J200211512183320M ax Well et al.Cur O p i n G enet D evel O p2*******!2002-12-16收稿"血浆中的可溶性受体刘晓静综述朱旭东李磊审阅第三军医大学野战外科研究所一室重庆400042摘要可溶性受体的来源大致分为膜受体的胞外段经水解酶水解释放基因选择性拼接病毒基因的表达人工基因重组可溶性受体的作用机制包括作为相应膜受体的竞争者阻断配体的信号转导作为血清结合蛋白转运稳定富集配体下调膜受体数量上调配体效应等其临床应用主要是作为某些疾病的监测指标和相应细胞因子的拮抗剂关键词可溶性受体血浆基因表达调控受体学说的提出至今已有百年1897年l an g-l e y根据阿托品和毛果芸香碱对猫唾液流出实验的对抗作用首次认为化学物质起始或改变细胞反应是通过作用在专一的作用部位他将细胞的接受部位称为受体rece p t Or并提出了两个基本概念一是对专一配基li g and的识别能力二是配基受体复合物cO m p l ex能启动生物反应受体有很多种分类方法其中之一是根据是否锚定于细胞核膜上而分为膜结合型受体m e mbrane-bOund rece p t Or 和可溶性受体SOl ubl e rece p t Or可溶性受体有一小部分位于胞浆内但大部分存在于胞浆外如血浆细胞间液等而血浆中的可溶性受体是作用最广泛且研究较深入的一种l可溶性受体产生的机制血浆中存在成千上万种功能各异的可溶性蛋白分子其中有一部分是作为受体执行功能的这部分可溶性受体大多都有其同源的相应膜受体并且二者关系密切而另一些则并未发现有相应膜受体它们作为一种正常的血浆蛋白而存在可与相应配体结合前者是本文讨论的重点血浆可溶性受体的来源大致有四一是来自于膜受体胞外段不排除其中有些是做为膜受体的清除形式之一而自膜上老化脱落但大部分则是在某种严格的调控机制下表达在膜上的结合性受体被某种特定的蛋白水解酶剪切而释放出结构上只含有胞外段的活性形式成骨细胞虽然也表达膜结合形式的I L-6R但它并不能传递信号只有经酶切释放出SI L-6R后才产生出相应功能这就使得成骨细胞能够通过控制水解酶的活性来控制自身对I L-6的反应1值得一提的是CNTFR cili ar y neur O-tr O p hi c f act Or rece p t Or睫状神经营养因子受体不。