实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色
【实验目的】
掌握荧光显微镜的原理和使用；
掌握生物材料荧光染色的原理和应用。

【实验原理】
吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。

其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。

在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。

吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。

【实验用品】
1、器材
荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。

2、试剂
（1）0.1mol/l pH7.0 PBS液
A液：NaH2PO4·H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml；
B液：Na2HPO4·7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；
取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。

（2）1%吖啶橙原液
取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍）。

3、材料
口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。

【方法与步骤】
（1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。

（2）95%乙醇溶液固定5min。

（3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。

（4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。

【结果与观察】
荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
【注意事项】
（1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。

（2）每种荧光染料，均有自己的最适pH，此时荧光最强。

当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。