后荧光显微镜观察。 11. 观察结果 肺癌细胞胞质中绿色或红色荧光所在区域即为actin的存在部位，在100倍油
镜下可以观察到tubulin呈绿色或红色丝网状均匀分布于胞质中。
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为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除非特异性染色导致的假 阳性结果，必须设立对照实验： ①阴性对照：用PBS或非免疫的二抗动物血清代替一抗，再用以上方法进行 染色，结果应为阴性。 ②阳性对照：用已知含有待测抗原的阳性细胞进行以上染色，结果应为阳性。
Na2CO3 0.6g双蒸水800mL；碱性缓冲甘油溶液：碳酸缓冲液1份与甘油（试剂级，
无荧光）9份混合均匀；小鼠抗人actin的单克隆抗体；FITC或Rhodamine标记的山
羊抗小鼠二抗。
3、仪器等 超净工作台，CO2培养箱，倒置相差显微镜，科学级荧光显微镜，冰箱，
微量加样器，移液管，吸管，细胞培养瓶，24孔培养板，湿盒，试管架，眼科镊，
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9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定 。20.11.2520.11.25Wednesday, November 25, 2020
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10、低头要有勇气，抬头要有低气。13:41:1913:41:1913:4111/25/2020 1:41:19 PM
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11、人总是珍惜为得到。20.11.2513:41:1913:41Nov- 2025-N ov-20
间接免疫荧光细胞化学法 显示细胞骨架
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【实验目的】
熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。 掌握荧光染料染色方法并观察其发出的荧光。 掌握免疫荧光细胞化学染色法的原理及操作步骤。 掌握用间接免疫荧光细胞化学染色法显示目前抗原的方法。
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【实验原理】
细胞骨架是维持真核细胞形态及参与一系列细胞生物学功能 的重要细胞器，微丝属于其中的重要成员，其中又以肌动蛋白 （actin）纤维作为主要成采用人actin或tubulin的单克隆抗体 结合该抗原，再使用FITC和Rhodamine标记的山羊抗小鼠二抗与一 抗结合，最终细胞中的绿色或红色荧光显示了目的抗原的存在。
3
【实验准备】
1、材料 体外培养的人肺癌细胞的飞片。
2、试剂 0.01MPBS溶液（pH7.4）：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，NaH2PO4 1.15g，
KH2PO4 0.2g，蒸馏水定容至1000mL；抗体稀释液（含BSA）；并甲醇或冰丙酮；
5%正常山羊血清封闭液；0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液：NaHCO3 3.7g，
谢谢大家
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培养皿，滤纸，载玻片、MARK笔。
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【实验内容与方法】
1. 从24孔培养板中取出培养的肺癌细胞飞片，PBS冲洗3-5分钟/次*2次。 2. 吸弃PBS，加入4℃冷甲醇固定10分钟。 3. PBS溶液冲洗5分钟*2次。 4. 吸弃PBS，滴加10%BSA封闭液，将飞片放入湿盒，室温下封闭10分钟。 5. 吸去飞片上的封闭液，不冲洗飞片，在飞片上滴加稀释好的抗actin一抗（稀释浓度需
提前经过预实验选择好），在湿盒中孵育1小时。 6. 用PBS冲洗10分钟*3次。 7. 在飞片上滴加二抗稀释液（稀释浓度需提前经过预实验选择好），室温下于湿盒中避光
孵育40分钟。 8. 吸弃二抗液体，用PBS冲洗10分钟*3次。 9. 加入DAPI（1：2000），放置10分钟，使用PBS洗3次，干燥飞片。 10. 滴加约5µL封片剂于载玻片上，将飞片细胞面向下盖于封片剂上，避免产生气泡，封固
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