! 课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型：
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i实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
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1 同组学生姓名：指导老师：
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实验地点：实验日期:
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一、实验目的和要求线
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二、实验内容和原理
i三、主要仪器设备
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四、操作方法与实验步骤
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1 五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析
七、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。
2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
二、实验内容和原理
以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下:
实验报告
1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%勺乙醇或80%勺丙酮提取。
2、皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
COOGH COO
MoONMg \ + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH
COOCHk COO
3、取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg+可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ )
褐色绿色
4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
5、定量分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值
之间有如下的关系：OD=Ca*k a1+G*k b1 OD=Ca*k a2+G*k b2
查阅文献得，叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下。
比吸收系数k
波长/nm
叶绿素a 叶绿素b 663
645
将数值代入式子得：OD663=*Ca+*Cb OD645=*Ca+*Cb
经整理后，得至V式子：Ca= OD663 - OD645 Cb= OD645 - OD663
三、主要仪器设备
天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等
四、操作方法与实验步骤
1、定性分析：
鲜叶5g+95%30ml（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。
皂化反应（3ml）:力卩KOF数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O 1ml分层后观察取代反应（1）：加醋酸约2ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
取代反应（2）：鲜叶2-3cm2,加Ac-AcCu 20ml加热。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层黄色石油醚溶液一稀释（470nm OD）
叶绿素a 叶绿素b 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素（盐）一稀释（663nm OD）
两者在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰
3、叶绿素定量分析：
鲜叶，加，磨成匀浆，各取加80%丙酮, 摇匀，4000 转离心3min, 上清液在645，652，663测定OD计算Chla,Chlb 和Chi总量的值。
五、实验数据记录和处理
1、定性分析：
观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。
皂化反应（3ml）：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。
下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。
取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色，为铜代叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
图1 图2
图一在420nm左右及690nm左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。
图二在450nm以及475nm波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。
3、叶绿素定量分析：
将数值代入式子，计算得:
Ca(mg/L)= --------------------------------------------------------------------------------------
波长/nm mg/L
645 652 663 Cb (mg/L)=
OD645=*
OD663=* mg/L OD 第一组
CT (mg/L)= 第二组mg/L
平均Chia 含量Ca+ Cb = (mg/=
(Ca(mg/L)/1000)*2/ *5/ = mg/
Chlb 含量(mg/ = ( Cb(mg/L)/1000)*2/ *5/ = mg/
Chl 总含量(mg/ = ( CT(mg/L)/1000)*2/ *5/ =
六、实验结果与分析
1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。
2、从定量实验所得数据的计算结果来看，实验所用的叶片中，叶绿素a的含量大约是叶绿素b的三倍左右。
3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是以下几个原因造成的：1.
研磨的充分程度不同2.所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别
七、讨论、心得
1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？
叶绿素有基态（G）,第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3）, 光子吸收必须遵守普朗克定律。
被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。
蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2,而红光能量小，只能使其跃迁到E1,故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。
2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？
因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。