肺癌细胞抑制中英文对照外文翻译文献(文档含英文原文和中文翻译)介导性shRNA能抑制肺癌细胞中livin沉默基因的表达从而促进SGC-7901细胞凋亡背景—由于肿瘤细胞抑制凋亡增殖,特定凋亡的抑制因素会对于发展新的治疗策略提供一个合理途径。

Livin是一种凋亡抑制蛋白家族成员，在多种恶性肿瘤的表达中具有意义。

但是, 在有关胃癌方面没有可利用的数据。

在本研究中,我们发现livin基因在人类胃癌中的表达并调查了介导的shRNA能抑制肺癌细胞中livin沉默基因的表达，从而促进SGC-7901细胞凋亡。

方法—mRNA及蛋白质livin基因的表达用逆转录聚合酶链反应技术及西方吸干化验进行了分析。

小干扰RNA真核表达载体具体到livin基因采用基因重组、测序核酸。

然后用Lipofectamin2000转染进入SGC-7901细胞。

逆转录聚合酶链反应技术和西方吸干化验用来验证的livin基因在SGC-7901细胞中使沉默基因生效。

所得到的稳定的复制品用G418来筛选。

细胞凋亡用应用流式细胞仪(FCM)来评估。

细胞生长状态和5-FU的50%抑制浓度(IC50)和顺铂都由MTT比色法来决定。

结果—livin mRNA和蛋白质的表达检测40例中有19例(47.5%)有胃癌和SGC-7901细胞。

没有livin基因表达的是在肿瘤邻近组织和良性胃溃疡病灶。

相关发现在livin基因的表达和肿瘤的微小分化和淋巴结转移一样(P < 0.05)。

4个小干扰RNA真核表达矢量具体到基因重组的livin基因建立。

其中之一,能有效地减少livin基因的表达,抑制基因不少于70%(P < 0.01)。

重组的质粒被提取和转染到胃癌细胞。

G418筛选所得到的稳定的复制品被放大讲究。

当livin基因沉默,胃癌细胞的生殖活动明显低于对照组(P < 0.05)。

研究还表明,IC50上的5-Fu和顺铂在胃癌细胞的治疗上是通过shRNA减少以及刺激这些细胞(5-Fu proapoptotic和顺铂)(P < 0.01)。

结论—livin基因在胃癌中的过分表达与肿瘤分化与淋巴结转移建立联系,建议了治疗胃癌病例分子预后因素之一。

ShRNA可以抑制在SGC-7901细胞中的livin基因表达,诱导细胞凋亡。

Livin可以作为治疗胃癌凋亡的新目标。

1．介绍胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。

大多数患者被诊断为这个疾病的阶段,在最佳时间的机会错失了手术治愈。

尽管有很大改善,但处于晚期胃癌的化疗患者的总体存活率仍然很低。

癌症细胞化疗耐抗性可能导致手术失败。

在耐药的原因中,抑制细胞凋亡的过程会起重要作用。

癌细胞常有抗凋亡增长的特征[1],介导其增加的阻力不同来刺激的细胞凋亡,如DNA损伤、缺氧、营养损失[2、3]。

此外, 在临床实践中细胞凋亡抵抗被认为是肿瘤手术失败的主要原因,因此许多化疗药物和/或放射线疗法都是通过诱导凋亡肿瘤死亡实现的[4]。

酶抑制剂(IAPs),是一种新型的凋亡蛋白抑制基因家族[5,6],包括病毒感染,化疗药物, ,生长因子和肿瘤坏死因子-α(TNF-α凋亡信号通路)/ Fas信号通路[7 - 9]。

IAPs是由一组有凋亡特性的结构相关的蛋白质构成[10]，在预防肿瘤细胞凋亡方面可能扮演一个重要的角色,并已成为近年来研究的热点。

这个家庭的新成员是ML-IAP/livin/KIAP/BIRC7 (以下称为livin)有两个种类、livinα和livinβ[11-14]。

有证据表明, livin的过分表达能阻止由多种刺激诱导的细胞凋亡[12]。

有趣的是, livin基因被发现在肿瘤细胞中限制性表达,但是不存在或是很少数量存在于正常成人体组织中[11-15],并且通过允许恶性细胞,以避免凋亡细胞死亡的方式导致肿瘤形成,。

所以抑制livin基因表达可能会呈现出一个有趣的治疗策略。

在目前的研究中,我们调查了livin的表达在胃cancinomas及其邻近组织。

livin 的表达和临床病理参数之间的关系进行了分析。

此外,我们探索了在抑制livin基因表达的shRNA可行性和胃癌易感性的凋亡细胞由shRNA介导的livin沉默基因。

2患者和方法2.1 患者和肿瘤样本胃癌中四十个病例及接受胃切除手术的患者收集到的胃癌组织中13个病例(患者年龄从29~77岁)。

其中良性胃溃疡的13个病例(慢性浅表胃炎)患者在接受了胃内视镜检查(患者年龄从33~77岁)。

这些病例均来自南京医科大学第一附属医院。

胃癌患者被诊断为TNM级的1~4阶段(UICC ，2002)。

手术之后肿瘤标本就立即被冻结在液态氮中,储存在-80℃直到使用为止。

这是在所有的病人知情同意的情况下获得的。

2.2逆转录聚合酶链反应技术程序总共RNA(2毫克)提取冷冻组织反转录进行，最后的体积2微升是用100 pmol of oligo(dT)15和200U M-MLV与逆转录酶(promega、美国) ,根据制造商的说明。

Aliquots对应的250微升cDNA被放大在PCR缓冲容器中，在最终的50微升中含25pmol / ml处理剂和1U聚合酶。

每一个放大了35周期,一个周期的变性曲线在30 s内到达94℃。

热处理在30s内59℃（livin and b-actin）扩大到30s内72℃。

没有RNA的病例作为阴性对照物包含在RT–PCR中。

一系列常用的的livin和β-actin处理剂如下：livinα / βupstream，5＇-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3＇;livinα/ βdownstream;5＇-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3＇;β-actin upstream,5＇-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3＇β-actin downstream,5＇-AGCGCAAGTACTCCGTGTG-3＇。

产品的尺寸分别为livinα/β是312/258 bp ，β-actin 是501bp。

2.3 西方吸干技术分析病变同质性与冲力缓冲50mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl,0.1% NP40和5mM EGTA包含50mM氟化钠，60mM β-丙三醇-磷酸盐,0.5mM钒酸钠,0.1mM苯甲基磺醯化氟10μg/ml亮抑蛋白酶肽。

用考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量。

蛋白质样品电泳10% 变性SDS凝胶并转移到PVDF膜(Roche、美国)。

膜是培养特定的主要的抗体,与过氧化物酶继发性抗体反应(细胞信号技术、美国),最后通过增强化学荧光达到可视化(细胞信号技术、美国)。

Alexesis(美国) 和散塔克鲁兹生物技术(美国)购买的单克隆抗体livin (1:250) and actin (1:400)24细胞系和细胞培养我们选了一个人类胃腺癌细胞系在这一研究中。

SGC-7901(上海细胞研究所,中国上海,)是一种附着中度分化胃腺的人类细胞株。

线是胃癌细胞上皮细胞,并成长为附着细胞RPMI 1640 (Hyclone Inc, USA)含10%FCS (Life Technologies, Inc.),每毫升100个单位的青霉素和毫升100微克的链霉素(BioWhittaker)。

在含有5%CO2空气的条件下的37℃湿润培养器中保存SGC-7901细胞。

溶解顺铂和氟尿嘧啶(齐鲁制药厂、中国)在DMSO并且4℃储存。

2.5。

ShRNA的合成和PGPU / GFP /Neo/livin质粒的制造通过siRNASequence-Selector软件设计并合成了Livin的ShRNA序列(上海生物技术有限责任公司。

集团公司、中国)。

序列如下(表1),然后被插入pGPU/GFP/Neo(上海GenePharma股份有限公司。

中国) BbsI and BamH地址产生pGPU/GFP/Neo/livin and pGPU/GFP/Neo/Control质子。

2.6SGC-7901的建立稳定表达pGPU/GFP/Neo/livin and pGPU/GFP/Neo/Control转染实验,SGC-7901细胞被镀成6孔板(3×105孔密度), , 96孔板(1 ×104孔密度)和12孔板(1.5 ×105孔密度)转染之前培养24小时。

按照制造商的说明这些细胞被调控子用Li-pofectAMINE 2000转染4毫克/孔空的pGPU/GFP/Neo/vector，pGPU/GFP/Neo/livin或pGPU/GFP/Neo/Control 质粒(生命技术公司、大岛屿,NY)。

转染48小时后,这些细胞被转移在1:15 (v/v)并用Geneticin (G418) 1000克/毫升培养4周。

稳定转染的克隆体取出并保存在媒介容器400 g/ml G418用作另外的研究。

2．7依赖贴壁细胞细胞生长的测定亲本细胞和细胞稳定表达pGPU/GFP/Neo/vector, pGPU/GFP/Neo/livin or pGPU/GFP/Neo/Control被种到6孔盘子中。

每隔一天收集三孔的细胞。

使用计数器确定细胞数目(Coulter Electronics, Miami, FL).。

种植一些天数后用平均SD记录每孔细胞的数量。

2.8MTT测定通过MTT对细胞毒性进行了测量。

呈几何数增长的细胞被镀在密度为10000细胞/孔的96孔板上作用24小时。

接下来这些细胞被以不同浓度的药物治疗48小时。

每孔加入100微升MTT溶液(1毫克/毫升),并且这些细胞放在37℃下培养四小时。

上层清液用异丙醇代替溶解有色甲品。

用micro-ELISA测量到吸光率的波长为595nm(ClinBio-128 SLT,,奥地利)。

治疗细胞的吸光率相当于计算控制细胞的吸光率并用细胞死亡百分率显示出来。

2.9流式细胞术细胞被收集并加入冰冷的70%乙醇于PBS缓冲液中储存在-4摄℃暖直到使用。

悬浮后后，100 ml核糖核酸酶I (1 mg/ml) and 100 ml 的聚酰亚胺(400 μg/ml) 37℃下培养细胞并用流式细胞术(BD,美国)进行分析。

2.10统计分析数据的展现要用至少三个不同实验±SD的方法。

实验结果用学生的t检验来分析和当P < 0.05时被认为是具有统计学显著性。

3结果3.1。

livin在胃肠癌中的表达在目前的研究中,我们第一次验证了逆转录聚合酶链反应技术和西方吸干技术的存在在40胃癌中,13 癌组织和13良性病变胃粘膜损伤。

在癌组织和良性病变胃粘膜损伤中, 每个mRNA亚型不可见水平被发现后,在肿瘤组织中,19/40(47.5%)显示出mRNA及livinaα和livinβ蛋白质表达(Figs. 1 and 2). 。