实验论文
题目有关冷丙酮沉淀蛋白时间及其效果研究专业生命科学与技术
姓名贺位皇
职称实验技术员
二〇一四年十一月
目录
摘要 (1)
关键词 (1)
前言 (1)
1材料与方法 (2)
1.1样品采集 (2)
1.2方法准则 (2)
1.3实验步骤 (2)
2结果分析 (3)
2.1不冷丙酮沉淀蛋白的不同时间与最终所得蛋白浓度之间的较 (3)
2.2冷丙酮沉淀蛋白的不同时间与各蛋白胶图条带的比较 (4)
3讨论 (4)
参考文献 (5)
有关冷丙酮沉淀蛋白时间及其效果研究
贺位皇
（华大基因研究院质谱平台）
摘要：本研究抽选大麦为对象，采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白，严格控制冷丙酮沉淀蛋白时间，观察相对应时间下蛋白提取的结果。
结果表明：用冷丙酮沉淀样品蛋白的时间与最后得蛋白浓度成反比。
关键词：冷丙酮，沉淀蛋白时间，蛋白浓度。
前言
蛋白质（protein）是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。
没有蛋白质就没有生命。
因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。
机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。
人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
丙酮（acetone，CH
3COCH
3
），又名二甲基酮，为最简单的饱和酮。
是一种无色透明
液体，有特殊的辛辣气味。
易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂。
易燃、易挥发，化学性质较活泼。
目前世界上丙酮的工业生产以异丙苯法为主。
丙酮在工业上主要作为溶剂用于炸药、塑料、橡胶、纤维、制革、油脂、喷漆等行业中，也可作为合成烯酮、醋酐、碘仿、聚异戊二烯橡胶、甲基丙烯酸、甲酯、氯仿、环氧树脂等物质的重要原料。
丙酮沉淀蛋白的机理是：根据库伦定律，溶液介电常数的下降（丙酮25摄氏度时介电常数为21，水为81），造成静电作用力的增强，同时，丙酮与蛋白对水的争夺直接导致水化层的破坏，从而造成蛋白沉降。
丙酮造成蛋白变性的原因：常温或升温时，蛋白立体结构展开，丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结合导致蛋白变性，所以我们通常预冷丙酮并且低温操作。
低浓度的盐不会沉淀，但是通常盐浓度高于0.1molL时，因为介电常数的降低导致盐的溶解度也下降而析出。
初始蛋白浓度不易过高，很容易造成共沉淀。
1材料与方法
1.1样品采集
选取同一植株的大麦麦粒。
1.2方法准则
以冷丙酮沉淀植物蛋白的时间为单一变量。
1.3实验步骤
1.3.1 称量同植株大麦麦粒样品4份，各份取1g进行提取实验；
1.3.2 将各样品置于研钵，加入10%的PVPP，在液氮条件下研磨成粉末；
1.3.3 把粉末转至50ml的离心管中，加入5ml Lysis Buffer 3，终浓度为1mM的PMSF、
2mM的EDTA，混匀，置于冰上5min后加入终浓度为10mM的DTT，冰浴超声5min；
1.3.4 15000g*4℃离心20min，取上清转入新的50ml离心管中，加入5倍以上体积
10%TCA/冷丙酮，终浓度为10mM的DTT，沉淀时间为t min；
1.3.5 15000g*4℃离心20min，弃上清；
1.3.6 把沉淀物转移至1.5ml的离心管中，加入1ml冷丙酮，终浓度为10mM的DTT，
捣碎沉淀，置于-20℃ t min，25000g*4℃离心20min，弃上清；
1.3.7 重复步骤5两次；
1.3.8 简单风干沉淀中残余丙酮，加入适量 Lysis Buffer 3，终浓度为1mM的PMSF、
2mM的EDTA，捣碎沉淀，混匀，5min后加入终浓度为10mM的DTT，冰浴超声5min；
1.3.9 25000g*4℃离心15min，取上清；
1.3.10 向蛋白液加入终浓度10mM的DTT， 56℃水浴1h；
1.3.11 加入终浓度55mM的IAM，暗室放置45min；
1.3.12 用5倍体积的丙酮沉淀蛋白液t min，25000g*4℃离心20min去上清；
1.3.13 加入1ml丙酮，捣碎沉淀， -20℃放置30min后，25000g*4℃离心20min去
上清；
1.3.14 风干沉淀中残余丙酮，加入适量 Lysis Buffer 3，冰浴超声5min；
1.3.15 25000g*4℃离心15min，取上清用于定量。
2结果分析
2.1冷丙酮沉淀蛋白的不同时间与最终所得蛋白浓度之间的比较
许多研究表明，冷丙酮沉淀蛋白时间过长会导致蛋白质降解，时间过短会使蛋白质沉淀不完全。
所以控制沉淀蛋白的时间相当重要。
通过查阅文献和网上资料，选取了四个有代表性的时间10min，30min，60min，120min。
用BSA牛血清蛋白做标曲，采用Bradford蛋白浓度测定标准操作规程（Bradford工作液（考马斯亮蓝G-250）和蛋白在酸性条件下结合时，在一定的范围内，蛋白质含量与在595nm的吸光值成正线性相关关系）。
定量标曲如下：
根据标曲，测得各沉淀蛋白时间t与其蛋白终浓度的数据如下：
由上可知，冷丙酮沉淀大麦的时间10min时，蛋白浓度最高，且可以推出随着沉淀时间的增长，蛋白的终浓度有所下降。
2.2冷丙酮沉淀蛋白的不同时间与各蛋白胶图条带的比较
由胶图可以看出，各时间段胶图条带相似，无明显差别，可见，沉淀蛋白时间的长
短，对蛋白含量分布，没有什么重大影响。
3 讨论
冷丙酮提取蛋白法中最耗时的属于冷丙酮沉淀样品蛋白的这段时间。
然而，该研究表明：并不是随着冷丙酮沉淀蛋白时间的增长，所得蛋白的终浓度也随之增大。
然而，由于受到样本单一性和实验单一性的影响，无法决定所有生物样本在冷丙酮沉淀时间里，呈现冷丙酮沉淀样本蛋白时间在10min 时，所得蛋白浓度最高，且随着沉淀时间的增长，蛋白的终浓度有所下降的这个结论。
而且也不能得知在哪个沉淀时间段里，所得蛋白浓度最高以及冷丙酮沉淀蛋白时间与所得蛋白终浓度的理论关系。
必须经过大批量不同样品的实验探索以及控制更细微的冷丙酮沉淀蛋白时间的变化来分析所得蛋白浓度。
综上所述，冷丙酮沉淀蛋白的时间最适宜并不是在2h 及以上，在10～3min 里，也可以得到不错的蛋白浓度及条带。
并不是所沉淀的时间最长，所得蛋白的浓度越高，长时间的冷丙酮沉淀蛋白可能是蛋白变性降解。
泳道 样品 M Marker 1 10min 沉淀 2 30min 沉淀 3 60min 沉淀 4
120min 沉淀
KDa M 1 2 3 4
97 66 31
20 14
43
分离胶的浓度 12%, Marker 上样量10μg, 每个样品上样量30μg.
参考文献
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