流感病毒神经氨酸酶抑制剂的合理设计与筛选摘要流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的上呼吸道疾病，每年影响数百万人的健康，造成比较严重的经济和社会问题。

但是到目前为止，人类对流感病毒一直缺乏安全有效的控制手段，这使得抗流感病毒药物研究成为当前药学研究的一个热点。

随着病毒学研究的进展，对流感病毒复制和感染过程的机理研究取得了重大的突破，在此基础上提出了一些可作为抗流感药物研究的靶标，比如：血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白MZ以及核酸内切酶等。

本文以其中的一种靶标化合物即神经氨酸酶为研究对象，对其抑制剂做出合理的设计及筛选，为研究与合衬抗流感病毒的药物提供一个较为合理的方向。

关键词：流感；流感病毒；神经氨酸酶；定量构效关系1、立项依据1.1、流感的危害以及防治现状流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道传染病，具有传染性强、流行面广、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。

流感感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的心、肾等多种脏器衰竭并能导致死亡。

流感可以通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。

有数据表明，每次流感爆发期会使全球人口的近10%感染致病。

仅在20世纪，流感的大流行就有三次，每次均使25%~35%的人感染致病，死亡率超过2%。

迄今为止，世界上已发生过五次流感的大流行和若干次小流行，造成数十亿人发病，数千万人死亡，严重影响了人们的生活和社会经济的发展。

而预防和治疗流感给人们造成了沉重的经济负担，并导致劳动力的下降和人力资源的紧张。

然而面对己对人类健康、社会经济造成严重破坏的流行性感冒，人类却一直缺乏有效的手段。

1.2、有神经氨酸酶抑制剂预防与治疗流感的现状NA抑制剂是目前探索抗流感化学治疗药物研究中取得的突破性进展。

它可以有效地阻断流感病毒的复制过程。

与其它类型的抗流感病毒药物相比，NA抑制剂具有更高的疗效及更好的安全性和耐受性，并对所有的流感病毒亚型均有效，也很少出现病毒的抗药性。

目前上市的NA抑制剂有两种:葛兰素公司得到Relenza罗氏公司的Tamiful，此外，还有一些神经氨酸酶抑制剂类药物正在开发中，如BioCryst公司的BANA-113、BANA-206；Abbott公司的A-315675等。

由此可见，由于神经氨酸酶抑制剂类药物所具有的独特机制及疗效，它们己成为世界各大医药公司竞相研究的热点。

1.3、立项意义作为一类新型的抗流感病毒药物，NA抑制剂较金刚烷胺类药物抗病毒谱更广、耐药率低且不良反应少，显示出较好的临床疗效"早期治疗不仅能减轻症状、缩短病程并促使患者迅速恢复，而且能够减少流感的并发症和相关抗生素的应用。

Oseltarivir对于流感的预防有确切的作用，尤其是在患者不能接种疫苗、对疫苗无反应或接种疫苗无效时，其预防作用更为重要。

综上所述，流感病毒神经氨酸酶抑制剂是继金刚烷胺/金刚乙胺和病毒疫苗之后的一类具有全新作用机制的流感预防与治疗药物。

它可同时抑制A型和B 型流感病毒，不易引起抗药性且耐受性好流感病毒神经氨酸酶抑制剂的开发成功是目前探索抗流感化学治疗药物研究中取得的突破性进展。

研究证实它能抑制流感病毒的复制，降低其致病性，可减轻症状、缩短病程、减少并发症，并且毒性较低。

可以预计随着它在临床上的推广使用，将极大地减轻流感对人们健康的威胁。

因此流感病毒神经氨酸酶抑制剂作为一类新颖的抗流感病毒药物将会具有更为广阔的发展前景。

2、项目研究内容2.1、神经氨酸酶抑制剂的设计思路2.1.1、经氨酸酶与底物作用机理1974年，Meindl等人发现NA催化反应的过渡态类似物Neu5Ac2en可以等效地抑制病毒和非病毒的神经氨酸酶的活性，因而推断神经氨酸酶的活性位点具有高度的结构相似性。

对神经氨酸酶与α-Neu5Ac复合物的晶体结构研究发现，底物在结合时，可以由能量上占优势的椅式构象转变为扭曲的船式构象，这种构象的改变部分是由于底物的梭基与NA活性位点的三个精氨酸残基形成盐桥而导致的。

同位素研究和分子模拟研究表明，NA对底物的催化作用主要是通过形成酶稳定的唾液酸氧鎓离子中间体1。

中间体1再与水分子发生立体选择性反应，优先生成α-Neu5Ac，α-Neu5Ac再转变为动力学更稳定的异构体β-Neu5Ac。

神经氨酸酶的复合物共价键的形成是在Neu5Ac2en和NA高度保守的位于N-乙酰神经氨酸C-2下方的酪氨酸残基之间；另外，Neu5Ac2en及其结构类似物对很多神经氨酸有较好的抑制活性的事实也有力的支持了平面氧鎓离子过渡态的设想。

2.1.2、合物的合理设计实验表明2-氨基噻唑-4-乙酸乙醋和2-苯基-4-噻唑烷酸具有一定的NA抑制活性，其IC50分别为358umoL和21。

3umoL，可以作为先导化合物对其进行结构修饰。

以这两个化合物作为NA抑制剂设计、合成的先导化合物，结合计算机辅助药物设计对齐进行结构优化，以得到NA抑制活性增强的噻唑和噻唑烷类NA抑制剂，作为具有全新母核的NA抑制剂的研究开发提供理论基础。

2.2、感病毒神经氨酸酶的生物活性评价通过大量的实验表明选择流感病毒神经氨酸酶作为抗流感病毒药物的靶点，根据流感病毒神经氨酸酶的三维结构及与其活性位点作用的抑制剂的药效团模型，结合体外对神经氨酸酶抑制剂活性的初步筛选，确定2-氨基噻唑-4-乙酸乙醋和2-苯基-4-噻唑烷酸作为先导化合物，并利用计算机辅助药物设计进行合理药物设计，对先导化合物进行结构修饰，设计、合成了噻唑类和噻唑烷类两类新型的小分子流感病毒神经氨酸酶抑制剂。

所设计的这两种化合物均具有一定的神经氨酸酶一直记得活性，并且绝大多数的化合物对NA的抑制活性都比先导化合物有所增强；其中第一系列-噻唑类NAIs中活性最好的化合物为L4d，其活性比阳性对照弱20倍；而第二系列-噻唑烷类NAIs中活性最好的化合物为Y4f，其活性比阳性对照弱7倍。

这些结果说明，噻唑和噻唑烷类都可以作为新型神经氨酸酶抑制剂的全新母核，并且在以后研究中，可以使用发现的这些化合物作为抗流感病毒先导化合物，进行进一步的结构修饰和优化，来发现活性更好的、可作为抗流感药物开发的新型流感病毒神经氨酸酶抑制剂。

2.3、目标化合物的构效关系研究2.3.1、比较分子场与定量构效关系研究本研究通过COMFA方法来获得流感病毒神经氨酸酶抑制剂的三维定量构效关系，应用Surflex-Dock对接方法与构象系统搜索确定神经氨酸酶抑制剂的可能活性构象，并以此活性构象为模板构建小分子化合物的三维结构，最后运用COMFA方法对其进行定量构效关系研究。

2.3.2、板化合物的选择及构象确定确定抑制剂的活性构象是COMFA模型建立的关键步骤，根据3D-QSAR的一般规律，具有手性碳原子的化合物应分别用单一的光学异构体进行分子建模。

本研究中，选择产物中占据大部分的Yanti进行分子建模。

在设定的分子对接条件下，使用Surflex-Dock化合物Y4fanti与2HU4的活性中心进行了对接选取对接构象作为化合物的药效构象，并作为分子叠合的模板。

进行QSAR研究的化合物分子以此构象为模板建立化合物库，并进行基于公共子结构的分子叠合。

2.3.3、化合物的COMFA模建使用SYBYL软件包中Edit/Build 模块中sketch构建了模板化合物Y4fanti，优化过程中采用Powell能量梯度法，Tripos力场，迭代1000次，能量收敛限定为2。

05Kcal/mol。

A。

定义Y4fanti中与R1、R2相连键作为可旋转键，每次以15°角递增旋转，选择Compute energy check box为ON，设定其OFF的最大能量差异值为1000 Kcal/mol，其他值均为系统默认值，对结果的能量值进行Histogram分析，选择能量分布最为集中的构象，作为可能的药效构象模版分子Y4fanti。

以Y4fanti作为模板，通过修饰相应的原子或集团分别构建了其他化合物，并通过能量优化得到三维结构。

2.4、化合物的活性筛选本研究使用商品化的神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒，以有荧光特性的化合物为酶促反应底物，建立了适合筛选小分子神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。

初步的体外神经氨酸酶抑制活性测试结果表明，所合成的化合物均具有一定的神经氨酸酶抑制活性，部分化合物活性达到林M级，虽然不及阳性对照oseltamivir，但可以作为先导化合物继续进行研究开发。

3、总结与展望有效的流感病毒神经氨酸酶抑制剂的研究主要基于以下几个方面:对酶作用机理的了解;流感病毒神经氨酸酶晶体结构研究得到的信息以及组合化学等合理药物设计技术的发展"已有神经氨酸酶抑制剂根据其结构可以分为唾液酸类、苯甲酸类、环己烯类、呋喃类、环戊烷类、吡咯烷类、多聚体类及其他类。

通过分子对接，探讨了两个系列化合物与神经氨酸酶活性区域的作用模式;采用比较分子力场分析(COMFA)方法构建了噻唑烷类化合物的定量构效关系(QSAR)模型，结合模型给出的等势线图对其构效关系进行了探讨，所构建的COMFA模型具有较好的交叉验证系数q2和预测能力，对于新型神经氨酸酶抑制剂的研究与开发具有一定的指导意义。

而不足之处在于，所发现的噻唑烷类化合物是以一对非对映异构体的形式存在，还没有对其进行分离，并且由于计算机模拟对接发现两者的活性有所差别，若将这一对非对映异构体分离，将可能发现活性比已测活性更好的化合物;另外，化合物的病毒活性测试也需完善。

流感病毒神经氨酸酶抑制剂是一类新颖的抗流感病毒药物，是进行合理药物设计、取得成功的典型实例。

流感病毒NA抑制剂对流感病毒的特性选择性高、抑制活性好!细胞毒性小，在临床研究中表现出疗效显著!患者耐受性好、不良反应小，并不易出现抗药性等优点，因此流感病毒NA抑制剂作为一类新颖的抗流感病毒将会具有更为广阔的发展前景。

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