[综 述]鞣质分析研究进展胡小刚, 李继革, 郭书好, 李素梅(暨南大学化学系,广东广州510632)关键词:鞣质;分析方法;研究进展摘要:本文介绍了当前国内外在鞣质分析研究工作中的进展,对鞣质各种定性定量分析方法进行了总结与评述,着重对鞣质的定量分析方法进行了论述。
中图分类号:R284 文献标识码:B 文章编号:100121528(2002)0320217203收稿日期:2001201212 鞣质又称单宁(Tannin ),是一类比较复杂的多元酚类化合物。
鞣质除在苔藓植物中很少含有外,广泛存在于植物界,约70%以上的中草药中含有鞣质类化合物[1],富含鞣质的如五倍子、贯众、方儿茶、地榆、柯子、大黄、牡丹皮、仙鹤草和老鹤草等。
鞣质的多元酚类结构赋予它一系列独特的化学性质,使它受到了国内外广泛的关注。
医药、林业、农业、食品、化工、环境等学科领域均有学者从不同角度开展了鞣质的基础和应用研究,尤其在医药领域的研究倍受瞩目。
目前鞣质的抗艾滋病(AIDS )研究令人关注,低分子量的水解鞣质,尤其二聚鞣花鞣质可作为口服剂来抑制AIDS ,仙鹤草素在浓度1μg/mL ～10μg/mL 时就可起到最强的抑制AIDS 病毒HIV 生长的效果[2]。
鞣质能清除生物体内过剩的自由基,维护细胞膜的流动和蛋白质的构象,防止辐射诱发的DNA 断裂,从而在抑制脂质过氧化、心血管病、抗癌、抗突变、抗衰老、抗白内障等方面有独到的功效[3]。
Okuda 等[4]用AOP/VC 或ADP/NADPH 诱发的大鼠线粒体及微粒体生成L PO 为指标,研究了25种鞣质及相关化合物,发现其中23种鞣质有不同程度抗氧化作用。
国外曾报道,缩合鞣质的前体儿茶素具有较强的抗癌活性,能有效地抑制癌细胞的生长[5]。
植物中的鞣质化合物对预防肿瘤和控制肿瘤进一步恶化有一定的作用,Schimmer [6]研究了鹅绒委陵草等植物中鞣质的抗突变作用,发现这些鞣质可明显抑制22NF 诱变性。
Y okoza 2wa [7]研究了含鞣质的生药,证明麻黄、盐肤木、柯子、肉桂、牡丹皮、老鹤草、芍药、石榴、孩儿茶中的鞣质均能明显降低尿毒症毒素2M G 。
一些水解鞣质,如鞣酸、云实素、贾木鞣花素、柯子酸本身就有降低血压的作用,提纯物活性高于原草药煎剂[8]。
吉田隆志[9]发现汉方药中鞣质有抑制骨质疏松的作用,并且不用担心副作用,将来可用于骨质疏松的预防和治疗。
近几年国外对鞣质药理活性的研究方兴未艾鞣质的药理价值被不断开发,其应用前途非常地广泛。
随着鞣质研究的不断深入,迫切需要对鞣质进行精确的定性定量分析,近几年鞣质分析方法的进展十分迅速,各种新方法不断涌现,本文作者对此进行了总结。
1 鞣质的鉴定鞣质分为可水解鞣质、缩合鞣质和新型鞣质,在对鞣质组分进行详尽的鉴定之前,一般要通过一些特殊的反应对鞣质进行类型分析。
常用的反应有三氯化铁反应、明胶氯化钠反应、溴水反应、乙酸铅2硫酸铁铵反应、香草醛浓硫酸反应、对二甲氨基苯甲醛反应、甲醛浓盐酸2硫酸铁铵反应等。
其中,三氯化铁反应显灰绿色,说明含有邻二酚羟基化合物,该鞣质为缩合型鞣质;溴水与缩合鞣质产生沉淀,与水解鞣质不沉淀;香草醛浓硫酸反应与对二甲氨基苯甲醛反应呈红色,说明存在儿茶素类缩合鞣质;甲醛浓盐酸2硫酸铁铵反应是鉴别可水解鞣质和缩合鞣质的著名反应,此法可将缩合鞣质和水解鞣质分离,甲醛盐酸煮沸将缩合鞣质沉淀滤去,水解鞣质不被沉淀留在溶液中用铁盐检查,灵敏度高,可达十万分之五[10]。
进一步的鞣质鉴定一般采取纸层析法、紫外法、红血球凝聚法和薄层层析法,其中目前最常用的是薄层层析法[11,12,23,14]。
纸层析法[15,16]的分离效果较差,斑点重叠不集中,拖尾现象较严重。
与纸层析法相比,薄层层析法的分离效果好,斑点集中,检测鞣质的分解产物没食子酸的重现性好,灵敏度高。
近年来新技术、新方法的应用有力地推动了药用植物中鞣质的研究,尤其是高效液相色谱的成功应用,为鞣质的研究增加了一双明亮的眼睛,高效液相色谱不仅可以检测鞣质组分中的α、β异构体,还可以预试鞣质分子的大小、判断结构测定中水解反应进行的程度。
刘延泽等[17]利用高效液相色谱从化香树的70%丙酮提取物中分离得出7种鞣质单体和一种二聚体。
文献[18]采用HPLC 为检测手段,经多次Toyopearl HW 240Sephadex L H 220、MCI 柱层分离,从刺莓果中检测出了10个鞣质类组分。
在鞣质的结构鉴定中,近年来大量使用光谱分析。
1H 2NMR 、X 2射线、CD FAB 2MS 、13C 2NMR 技术被大量使用。
应用CD 谱可以确定鞣质中HHDP 、DHHDP 的绝对构型;应用1H 2NMR 并结合化学降解产物的比旋度可分析得到整个分子的绝对构型;应用13C 2NMR 可以确定整个分子的碳骨架,确定各个官能团之间的结合位置。
这些较先进的技术和先712进的色谱分离方法结合在一起,已经阐明了数百种新鞣质化合物的结构。
金哲雄等[19]利用高效液相色谱和1H2NMR检测出蚊子草中7种鞣质类化合物。
森元聪等对从樟属植物[20]、七叶树[21]和越桔[22]中分离出的鞣质一一进行了分析,鉴定出了它们的结构。
Sakar M.k.[23]对月桂叶提取物的色谱馏分进行了1H2NMR鉴定,确定了4个鞣质馏分的结构。
随着更先进的二维核磁共振、质谱、色谱、光谱技术和新的检测手段的出现,分子量在500～3000之间的鞣质类化合物的结构测定将不会成为困扰人们的问题,只要分离出鞣质单体,就能鉴定出它的结构。
2 鞣质的含量测定2.1 鞣质的经典含量测定方法鞣质的经典含量测定方法有很多种,重量法、容量法、比色法、分光光度法等,这些方法至今仍被大量用于鞣质的含量测定,它们的特点是简单,容易操作,不需要贵重的仪器,因此特别在工业中被广泛应用,如用于饮料和工业废水中鞣质的测定等。
其中,最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合滴定法、比色法和分光光度法。
皮粉法是国际公认的鞣质含量测定方法。
皮粉中的主成分是蛋白质,鞣质可通过分子中的酚羟基与蛋白质中的酰胺基形成氢键而结合成不溶于水的沉淀,因此通过重量分析可测定鞣质含量,我国国家标准采用的就是皮粉法。
皮粉法适用的范围非常广,缺点是耗用样品多,测定时间长,而且没有选择性,其测定结果往往偏高,故一般只适用于测定鞣质含量高的生药,样品较少或含量低的则不适于测定。
K aruza[24]等用皮粉法测定了鼠尾草和蜜蜂花中的鞣质含量,结果比较接近理论值;刘宁[25]、张百舜[26]分别对矮杨梅和中药锁阳中的鞣质进行了分析,结果略偏高。
重量法一般使用皮粉,也可用其它沉淀剂,Reed[27]就用三价镱离子取代皮粉与鞣质结合进行重量分析,测定了双子叶植物叶中的鞣质含量。
干酪素法的特点在于干酪素能选择性地结合有生理活性的鞣质,因此测出的是有生理活性的鞣质,而无生理活性的鞣质如鞣酐则不被测定,选择性比皮粉法要高,一般适于测定鞣质含量较低的物质。
罗文毓[28]等对干酪素法和皮粉法进行了比较,实验表明干酪素法的结果明显低于皮粉法,且重复性好。
他用干酪素法测定了大黄及其炮制品中鞣质的含量[29]。
程立方[30]用于酪素法测定了侧柏叶中有生物活性的低含量鞣质。
高锰酸钾法利用鞣质有较多酚羟基易被氧化的性质,用高猛酸钾滴定样品液中鞣质。
同皮粉法一样高猛酸钾法选择性较小,易受样品中还原性物质干扰,误差较大,最大的优点是操作简单。
已报道的有在18种烧伤收敛中草药[31]、中药地榆[13]、醋炒槐米[32]等质量评价中的应用。
除了高猛酸钾外,常用的氧化滴定剂还有硫酸铈[33]及六氰合铁(Ⅲ)酸亚铁钾[34]等。
鞣质分子内的多个邻位酚羟基可作为多基配体与一个中心离子,如铜、锡、铋、锌、汞、铁等络合,形成环状的螯合物,在不同的p H值下发生沉淀。
络合滴定法就是利用鞣质这一性质,通过用EDTA返滴定过量金属离子来确定鞣质的含量。
已见报道的有刺梨[35]、鹿衔草[36]、墨荆拷胶[37]、viper’nest[38]紫苏[39]和罗布麻叶[40]中鞣质含量的测定。
杨伟[41]对络合滴定法和高猛酸钾法测定啤酒花中鞣质含量进行了对比,结果表明络合滴定法的准确度和精密度要高,终点更清晰明显。
比色法利用某些试剂与鞣质发生颜色反应,用比色计测定吸光度以确定鞣质含量。
常用的试剂有香草醛2盐酸[42]、普鲁士蓝[42,43]、Folin2Denis[43]和硫酸[42]等。
分光光度法是利用鞣质与某些试剂反应生成有色化合物,通过吸光度测定确定样品中的鞣质含量。
该方法在目前的应用最为广泛。
常用的显色剂有氯化铁[44]、氯化铁21,10二氮杂菲[45]、Folin2Ciocalteu试剂[46]、5%盐酸2丁醇[47]、甲胺基粉2重铬酸钾溶液[48]、Folin DAB8试剂[49]、Folin2Denis 试剂[50]、偏钒酸铵[51]等,这些显示剂的检测范围在可见区,一般在500～700nm波长之间。
已被用于检测果汁、果渣、啤酒、茶叶、高粱、制革污水和中药如五倍子中鞣质含量的检测。
鞣质在紫外区275nm波长左右处有较强的特征吸收,可以用紫外法对鞣质进行定量分析。
胡耀星[52]利用高岭土特异吸收鞣质,使鞣质的紫外吸收消失,用紫外法测得了柿子和柿酱中的单宁含量,最低检测限可达1～10μg・mL-1。
2.2 鞣质含量测定的新方法近年在鞣质含量测定方面也出现了一些新的方法。
这些方法包括高效液相色谱法、原子吸收分光光度法、薄层扫描法、热透镜光谱法、高灵敏示波电位动力学分析法、电化学传感器法等。
它们具有高灵敏度、高准确度和不易受干扰的共同特点,将会成为鞣质分析研究的主要手段。
高效液相色谱在鞣质分析中的应用,为鞣质定量分析开辟新的前景,已成为鞣质含量测定非常有效和准确的方法。
Salagoity[53]用高效液相色谱法测定了五倍子中五倍子鞣质的含量。
刘延泽等利用反相高效液相色谱成功地测定了茶叶70%丙酮提取物及其抗癌有效成分EGCG[17]。
罗文毓等人用高效液相色谱对大黄中没食子酸和d2儿茶素的含量进行了研究,测定出这两种鞣质的含量[54]。
已报道的还有槟榔花[55]、地榆[56]和茶叶[57]中鞣质含量的测定。
原子吸收分光光度法是利用鞣质与金属离子发生沉淀反应后通过测定过量金属离子间接测定鞣质的含量,沉淀剂一般为铜离子的乙酸铵溶液。
该方法简单快速,不受颜色及共存物质的干扰。
Y ebra[58]等利用原子吸收分光光度法测定了白酒和茶叶中鞣质含量,并结合流动注射分析技术用于工业上的实时质量监测。
杜小燕[59]等用此法间接地测定了5种茶叶中鞣质的含量,线性响应范围较宽。
Cladera[60]等报道了用热透镜光谱法测定白葡萄酒中鞣质的含量,其检测限达到了5ng・mL-1,与分光光度法约为100ng/mL的检测限相比,有了飞速的提高,为样品中痕量鞣质含量测定开辟了光明的前景。